蛋白质组学

独体—基于纤连蛋白类型Ⅲ结构域框架的抗体模拟 Akiko Koide and Shohei Koide

1. 介绍

蛋白质工程的一个主要目的是生产能够与特定靶分子结合的新的生物分子。这样的分子会应用于生物技术的许多领域,包括诊断、治疗和催化。虽然存在大量的天然蛋白,可供这些应用和开发,但用工程手段制造新的、有用的生物分子的办法仍是有吸引力的。 因为,它不受天然生物分子可用性的限制。抗体的基本构架中可变的链套呈现在基本不变的框架上,以及抗体工程的成功启发了一些研究组去发展“分子框架”[ 1,2] 。这些努力的主要目标一直是在保留呈递多重肽片段以与靶分子结合的能力的同时,克服抗体和抗体片段的缺点,包括大尺寸、杂二聚特性(除单免疫球蛋白结构域外)、低构象稳定性和难于大规模生产。至今已发展出来的,这样的人工分子都是基于免疫球蛋白片段或者小单体蛋白。

我们发展了以纤连蛋白 Ⅲ 型结构域(FN3 ) 为分子框架的应用。纤连蛋白是一个大蛋白,在胞外基质生成和细胞间相互作用中起基本的作用。它由多次重复的 3 类(、Ⅱ 和 Ⅲ ) 小结构域组成 [3]。FN3 是广泛存在的结构域,在所有动物蛋白中,其出现率估计为 2% [4]。在人纤连蛋白中,有 15 个 FN3 的重复单位。我们的系统建立在 FNfn10 之上。FNfn10 是小的(94 个残基 )单体,且不含二硫键。正确折叠的  FNfn10 在细菌中的高表达是很容易的 [5]。FNfn10 的三维结构 [ 6,7] 最好描述为 β 三明治,类似于抗体重链结构域的易变结构域,只是 FNfn10 有 7 条 β 链,而不是 9 条( 图 6.1)。FNfn10 在其两端各含 3 条表面链套,具有载呈多重肽片段的能力。FNfn10 的这些特性使其成为分子框架的理想候选者。

我们证明了通过筛选离散化表面链套残基的 FNfn10 组合库,可以设计制造出新结合蛋白(称为独体),得到的独体,保留框架蛋白的整体结构和良好的构象稳定性 [8]。此外,因为 FNfn10 不需要二硫键来协助恰当的折叠和维持稳定性,所以独体兼容于任何筛选方法,包括噬菌体展示 [8],肽-核糖核酸融合 [9] 和体内方法,如酵母双杂交系统 [ 10 ]。我们还证明了独体可以很容易地用于细胞内 [10] 。

我们在本章描述构建组合库、用噬菌体展示和酵母双杂交技术筛选蛋白库和用细菌生产独体的方法。

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