蛋白质组学

绿色荧光蛋白的表达、检测及应用

 

【导言
绿色荧光蛋白(GFP)是1962年Shimomura等从多管水母 (Aequorivictoria ) 中分离得到,是分子量为20kD的单链蛋白。当它和Ca 2+ 以及腔肠动物荧光素结合后,可发射荧光。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,后来人们将这种蛋为绿色荧光蛋白。野生型GFP荧光强度较低,受温度影响大,其应用受到了限制。1995年, Heim等采用定点突变的方式,把第65位丝氨酸换成苏氨酸或胱氨酸,荧光强度提高了4~6倍。后来的研究中用到的gfp突变体都是在此基础上通过改变若干碱基而得到的。
gfp作为一种新型的非酶性报告基因,能与多种不同蛋白质的N端或C端融合表达而不影响各自的特征,即融合蛋白质在细胞内仍能行使正常功能,而且融合蛋白保持与GFP 相似的荧光特性,所以应用范围很广。如,将目的基因与gfp融合,导入 生物 体内进行表达,然后观察融合蛋白在细胞内的位置。检测简便,不需要任何外源底物或辅助因子,是一种直观性很强的遗传标记物。运用GFP融合蛋白,可以观察植物细胞骨架的动态变化、细胞器动力学和内膜系统的运输、信息转导、病毒的运动和大分子的运输。另外,GFP生色基团的形成无种属特异性,在原核和真核细胞中都能表达,其表达产物对细胞没有毒害作用,并且不影响细胞的正常生长和功能,在转基因研究中得到了广泛的应用,已有GFP小鼠用于研究肿瘤的形成过程等。
【实验要求】
1.如果你获得一个可以在真核细胞中表达GFP的质粒,如何对它进行鉴定?如何确定此质粒可以表达?其检测方法有哪些?
2.根据示范中心的实验条件,你准备实施哪些实验进行验证?具体的实验原理和操作方法是什么?
3.查阅文献,如何制备表达GFP的转基因小鼠?并阐述其应用原理和预期结果。
【结果评定】
由评议小组根据学生提交的实验设计方案、具体的实验操作步骤、根据实验所得的结果及查阅文献、综合分析资料的情况进行评议,给出综合成绩。
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