蛋白质组学

请帮忙回答我的问题,诚谢!

Allen He/何小姐,

颂安!

我是武汉的一位生物学科研人员,上次在水生所参加过一次您主讲的pet系统讲座,及其相关的内容,并且获得了会上派送的资料,非常感谢,novagen的这本册子对我帮助很大,感谢merck生化组,还有您何小姐给中国生物学工作者所作的努力!那天我在会上问到一个关于kan抗性机理的问题,我说的是kan基因编码一种磷酸转移酶,此酶将磷酸基团转移给卡那霉素,而使之灭活。我的问题是,这种磷酸转移酶是否像beta内酰胺酶一样,属于一种分泌性蛋白酶,在表达的全程中是否需要不断添加?我自己的资料很有限,这个问题无法得到解决,现在想请你们帮忙,不知道你们有什么好的见解,谢谢!

此信还想向你们请教几个问题,烦请帮忙回答,感激不尽!

是这样的,我现在做一个人的营养蛋白的表达,目的在于将来能够产业化。这个蛋白比较特殊,成熟蛋白136aa,有20%的密码子属于ecoli稀有密码子,该蛋白理论分子量15KD左右,pI9.5,亲水性较强。并且活性结构是同源二聚体,分子内有三对链内二硫键,两个分子之间靠一对分子间二硫键形成同源二聚体。利用pet的各种表达载体,这个蛋白在ecoli中实现了初步的表达,可是结果很不理想。pet28a(克隆于NcoI和BamHI之间)、pet32a(克隆于NdeI和BamHI之间)都实现了初步的表达,但是表达量非常低,SDS-PAGE中表达量不到5%,目标带几乎和对照没有区别,表达系统肯定没有问题,pet32a的对照表达了大量的trx标签。看见的弱表达带位于19kd的位置,与预期15kd有差别,此前在购买该蛋白抗体的时候,介绍中也提到了这个蛋白的分子量在19kd左右。后来做了western blot,初步证实19kd位置的带有明显现色,不过那一次的二抗用的比较多,出现了一些非特异的显色。

再往后我做分泌表达,使用的是pet22b载体,pelB信号肽引导分泌,目的基因克隆于NcoI和BamHI之间。诱导表达后检测发现表达量明显上升,可是目标蛋白的分子量却变成了21kd左右,比单独表达带大2kd左右,正好是pelB 22aa的分子量大小,表明信号肽序列没有被切除,周质蛋白分析没有发现目标蛋白,这几乎证明了我的蛋白没有分泌出来。接下来,我作了表达条件的优化,包括iptg,温度(最低到了25度),时间等,结果仍然没有改善。然后我换用一个热诱导的分泌表达载体,也是pelB引导分泌,结果与pet22b几乎一样!表达的蛋白量略高,大小与pet22b表达的带一样大,21kd左右。

以上就是我的大致实验,下面是我的问题,烦帮忙回答,谢谢:

1.我已经通过天源公司向novagen订购rosetta-gami(DE3)表达菌株,目的在于避开稀有密码子、二硫键丰富等问题。不知道这个菌在使用过程中有那些需要特别注意的地方?手册上说受体菌抗tet,kan,clm三种抗生素,在缺少tet和kan的情况下,两个还原酶的突变是否会回复?我如果在培养基中只加入clm和kan,利用pet28a进行单独表达,是否可行?为什么?

2.对于分泌表达,希望您能给我一些建设性的意见,后面我把在网上和大家讨论的资料贴出来,必要时请参考一下,谢谢。如果在大肠杆菌种无法正确分泌,在酵母表达系统中,比如用pPIC9K分泌表达载体,是否有可能实现分泌表达?

3.在rosetta-gami(DE3)中可否利用外源蛋白与Trx共表达达到促进二硫键形成的目的?比如从pet28a中利用XbaI位点将带有rbs,atg,外源基因和终止密码子taat的完整表达盒切下,插入pet32a载体XbaI位点,利用pet32a上面的启动子共表达外源蛋白和trx,这样是否可行?能否得到象融合表达同样的效果?

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粘贴开始

如何让亲水性很强的蛋白在ecoli中实现分泌表达?
hxwuchina(就是我自己)

130多个氨基酸残基的外源蛋白,在ecoli中用pelB信号肽引导分泌,发现表达量比单独表达高很多,可是就是无法分泌:与单独表达相比,大出了信号肽20几个氨基酸残基的大小(2kd),做了很多的表达菌和载体,都是一样,真是ft!

查阅文献说此蛋白ecoli中表达很困难(事实如此,单独表达两非常低,有众多20%左右的稀有密码子),而且借助软件分析发现其亲水性极高,所有位点都在treshold之上,“不分泌的蛋白很难实现成功分泌”,不知道还有没有办法让它分泌出来?低温诱导会不会凑效?

还有改用其它的表达系统,比如酵母表达,是否也很难分泌?

请赐教,多谢!

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jasperxu (感谢jasperxu战友!)

pelB 序列是自己加的?换一个载体试试。我用XL1-Blue preparing M13, it is fine.
I use pComb.

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yxiangmind (感谢yxiangmind战友长期的帮忙)

在ecoli中用pelB信号肽引导分泌,发现表达量比单独表达高很多?能否详细说明一下。所谓的单独表达是否为胞内非融合表达即ATG直接和目的基因连接?
细胞质膜蛋白,周质蛋白和外膜蛋白以带有N-端信号肽的前体形式在细胞质中合成,随后穿膜运送到周质或定位到内外膜上。在穿膜的过程中,信号肽被信号肽酶切除,将外源蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。许多信号肽序列被应用于大肠杆菌表达系统并成功地使目的蛋白转运到周质空间中,如大肠杆菌的phoA ,OmpA,OmpT,OmpF,LamB,pelB,cex信号肽 ,金黄色葡萄球蛋白A信号肽,枯草杆菌内葡聚糖酶信号肽和人生长激素信号肽等。但是并不是任何蛋白加上信号肽序列都可以转运到周质中的。一些结构相似的蛋白有的可以顺利地转运到周质空间中;有的在同样的条件下却不能。人们认为这样的现象可能是由于这样一些原因,如变弱的外膜的自溶作用,目的蛋白的产量低和蛋白质的不完全加工,以及大肠杆菌中待分泌蛋白的特性差异。具体的原因有待进一步的研究。
1. Ki Jun Jeong and Sang Yup Lee. Protein Expression and Purification 23. 311-318(2001)
7. Pascal Belin and Paul Louis Boquet. Microbiology (1994)140,3337-3348
影响实现分泌表达电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量等等。有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠,如低温培养、宿主菌的选择、某些氨基酸残基的取代、共表达分子伴侣、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌等。
例如,除了选择合适的信号肽和融合子外,培养的条件的选择也是很重要的。因为它影响着目的蛋白的分泌速度和表达水平。一般来讲,培养温度影响着分泌的速度,分泌速度又与蛋白质的正确的折叠有关;启动子和诱导剂的浓度影响着表达的水平。而且在研究中发现,利用不同的菌种,分泌的效果也是不同的。目前普遍接受的观点是在低温下培养细胞.J.Winter等人在人proinsulin的分泌表达中将dsbA和目的蛋白融合表达。他们在实验中发现几个参数影响着融合蛋白的分泌,如宿主菌和培养条件 ,特别是它的培养基的组成。加入L-精氨酸或者乙醇到培养基中能够提高三倍融合蛋白的产量。他们认为乙醇能够影响周质空间中proinsulin的氧化折叠,而精氨酸能够提高正确折叠的重组蛋白。利用这个培养条件最终获得的目的蛋白占总蛋白的1.8%。http://www.hdgene.com/zhishiruandi/2001/mindan.doc另外,选不同的表达系统对不同的蛋白结果可能不同。

yxiangmind

清华大学学报:为研究热休克蛋白Hsp16.3高度保守疏水片段中高度保守疏水亮氨酸残基(Leu121)对寡聚体结构和活性的影响,该残基被分别定点突变成天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)等。意外的发现结果发现当Leu121被突变成Val和Ala时,通过SDS-PAGE凝胶电泳检测仍可见重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达,而当被突变成Asp和Asn时,表达量低。为了确认究竟是什么原因引起Hsp16.3蛋白表达量的剧烈下降,重新构建了3个突变体,将Leu121分别突变成Asp, Ala和Val。 Leu,Val,Ala,Asp 和Asn的疏水系数分别为4.5, 3.8, 1.8, -3.5和-3.5 。如果是因为疏水性的破坏而导致Leu121Asn突变蛋白在E.coli细胞内的表达量急剧下降,那么当Leu121突变成疏水性的Val时,蛋白质表达量不会下降;而当Leu121突变成Asp时,蛋白质表达量将会象Leu121Asn 突变体一样急剧下降。在另外设计的3个突变引物中,除了突变位点121 残基的密码子不同外,其余碱基顺序均相同。这是为了排除引入E.coli细胞不喜欢密码子的可能。在选择Ala, Val和Asp的密码子时,都选用Hsp16.3基因中高频使用过的密码子。实验结果表明,当Leu突变成强疏水性的Val时Hsp16.3的高水平表达得到了维持。而当Leu121被亲水性的Asp替换后,突变蛋白的表达量急剧下降,几乎观察不到对应的蛋白带。这表明, Leu121被突变成高亲水性的氨基酸残基会破坏Hsp16.3的结构,导致突变蛋白被细胞内的蛋白酶水解。因此,“GVLTVTV”序列很可能是参与亚基之间相互作用的区域。究竟这一区域如何影响Hsp16.3的九聚体结构仍有待进一步深入研究。http://power.luneng.com/power/library/qhdxxb/qhdx99/qhdx9906/990613.htm
另外,看一下我不久前的帖子:http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=490447&sty=3&keywords=%B1%ED%B4%EF
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hxwuchina

感谢yxiangmind和jasperxu二位战友热心相助!

我的单独表达就是你所说的那样,表达两很低,全菌需要离心去除一半上清液,在SDS-PAGE中才可以看见弱的目标带。与pelB融合以后(使用过pET22b,pelB信号肽融合表达;另外还有一种热启动的表达载体,也是pelB),发现表达量明显上升,可就是比单独表达大2kd,周质空间分析没有发现目标蛋白,这表明蛋白没有分泌出来!

软件分析发现,此蛋白有20%的稀有密码子。亲水性很强,下面这张图是在dnastar中的分析结果,几乎所有残基的亲水数值都为正值,并且高的数值占比较大的比重。请帮助分析一下,这样的蛋白在理论上,能否在ecoli和yeast中实现分泌?

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hxwuchina

用bioedit分析的疏水曲线是这样的,坐标为疏水系数,与上面的分析大体一致,只不过数值正负相反。

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hxwuchina

我弄不清楚,到底是亲水性强有利于分泌,还是疏水性强有利于分泌,请高手指点!

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hxwuchina

请问:

你说的“硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌等”,自己有没有做过,请问效果怎么样?

“转型氨基酸残基”是什么意思?

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yxiangmind
硫氧还蛋白是低分子量(MW=11700)的氧化还原酶,在蛋白质折叠过程中可催化二硫键的正确形成。对大肠杆菌表达的重组蛋白正确折叠尤其有效。它做为一种有效的氧化还原剂用于蛋白质折叠中。l理论上利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌可以增加表达量。不过,我自己没有做过,呵呵~~,只是理论分析而已!
转型氨基酸残基 我的理解是这样:肽链关键氨基酸残基,可能影响蛋白的空间折叠构象。例如很多蛋白肽链转角处的蛋白。
我以前做分泌蛋白表达的时候,没有太多的考虑氨基酸亲水数值的影响。不过,理论上讲,疏水蛋白可作为折叠的核心,疏水的蛋白一般位于外部,因此应该更有利于分泌表达直接形成活性蛋白。

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hxwuchina

谢谢你的回答!
这里有一个不太容易理解的地方,那就是,Trx(硫氧还蛋白)作为氧化还原酶。其在外源蛋白折叠过程中的主要做用是不是“氧化”,而不是还原?在pet手册上没有写的很清楚,向这样的理论方面的知识一般很难自己找到答案,只有上网来求助象你这样在生化方面的高手了。手册上说,在trx还原酶(trxB)突变和谷胱甘肽还原酶(gor)突变的宿主菌内,可以增强二硫键的形成,前提是胞质中还必须有trx的存在。我的理解是,二硫键形成过程中,Trx作为氧化酶,使两个巯基之间脱氢,形成二硫键,这时,由于trxB和gor的突变,这两个主要酶的“还原酶”特性没有发挥出来,所以不能威胁到已形成的二硫键的稳定性,也就稳定了外源蛋白的正确折叠,是这样的吗?请指教!

谢谢你的回答!

原来是这样的,酵母和ecoli的分泌机制应该大同小异,是不是?在ecoli中不能分泌的话,酵母会不会也分泌不了?你那里有没有一些关于蛋白质亲水、疏水方面的资料,可否传一点给我看看?谢谢!

粘贴结束
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这么多的问题,希望你能够有耐心帮助我,急切等待您及贵公司相关技术人员的帮助!

祝商祺!

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