蛋白质组学

氯化镧抑制TNF-α诱导NF-κB信号通路活化

氯化镧抑制TNF-α诱导NF-κB信号通路活化
 
    观察氯化镧对NF-κB信号通路中关键分子的蛋白表达和磷酸化及NF-κB/p65亚基与靶基因结合能力的影响,探索氯化镧抑制NFκB活化的可能作用位点。以1×106个/ml接种细胞于含10%胎牛血清的RMPll640液体培养基中,于5%C02、37℃,恒温培养,随机分组如下:①TNFα组:以含TNFα20ng/ml的无血清培养基培养Hela细胞。②氯化镧+TNF-α组:分别以含氯化镧5,25,50和100gmol/L的培养基培养Hela细胞4h后弃培养基并以无热原生理盐水漂洗细胞三遍,再加入含TNFα 20ng/ml的培养基继续培养。③空白对照组:培养基为不含血清,不加氯化镧和TNFα。④氯化镧对照组:以含氯化镧100gmol/L的培养基培养Hela细胞。各组细胞根据检测方法的要求分别培养于24孔培养板或培养瓶中,于30min后,收集培养上清、细胞待检。运用Westernblot技术测定胞浆提取物中IrBa蛋白表达和磷酸化水平及胞核提取物中NF-κB/p65蛋白表达水平;最后用Transcription Factor Assay kit试剂盒测定胞核提取物中p65蛋白与DNA靶序列结合能力。
 
    结果表明:(1)氯化镧对TNF-α诱导的IκBa磷酸化和降解的抑制作用:TNF-α能够诱导Hela细胞中IκBa的磷酸化和降解。随着氯化镧处理的浓度不断升高,IκBa表达水平逐步升高,而磷酸化水平不断降低。表明氯化镧能够抑制TNF-α诱导的IκBa的磷酸化和表达水平的降低,且该效应随着随着氯化镧浓度的升高而逐步增强。(2)氯化镧对TNF-ct诱导的NF-κB活化的抑制作用:25―100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导胞核NF-κB/p65蛋白表达水平,5―100μmol/L氯化镧还能显著减弱Hela细胞中NF-κB/p65与靶DNA结合活性,上述抑制效应呈剂量依赖关系。
 
    NF-κB的激活剂TNF-α通过磷酸化IκBa,导致IκBa降解,使NF-κB/p65转位入核与靶基因启动子结合,以启动相关基因的表达;氯化镧通过阻断TNFα诱导IκBa磷酸化,抑制IκBa的降解和NF-κB/p65转位入核并阻断NF-κB/p65与靶基因的结合。


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