蛋白质组学

现代组织化学的发展

现代组织化学的发展
 
    近半个世纪是现代组织化学蓬勃发展时期。组织(细胞)化学新方法的建立,使其技术手段更精细,内容更丰富,如Mann自1902年起及此后许多学者的研究,逐渐建立了完善的组织冷冻切片技术,弥补了一般化学固定及石蜡包埋的缺点,可防止脂类、多糖类和无机盐的丢失,防止酶活性丧失等,推动了脂类、黏多糖及酶的组织化学研究。
    在蛋白质和氨基酸组织化学显色法的研究中,Danielli(1947年)建立了显示蛋白质(酪氨酸、色氨酸和组氨酸)的四氮盐反应,还有坂口(1925年)建立并经其他学者改进的精氨酸(组蛋白中富含)显色法,Danielli(1950年)和Pearse(19"年)等建立的SS基和SH基反应(显示胱氨酸和半胱氨酸,与角蛋白检测相关),vanGieson的胶原显示法,Foot(1925年)显示网状纤维的银浸法,Weigert、Verhoeff(1908)和Gomori(1950年)等的弹性纤维染色法,Mallory(1938年)的纤维蛋白染色法等。
    在核酸组织化学显色法的研究中,最著名的是Feulgen和Rossenbeck(1924年)建立的Feulgen-Schiff反应,用以显示细胞核内的DNA。另一个是Brachet于1940~1944年建立的甲基绿―焦宁(pyronine)染色法显示细胞内的RNA。此法使胞质和核仁内的RNA显红色,核内的DNA显绿色,标本色彩鲜艳,为研究者所乐用。
    碳水化合物组织化学显色法中,最著名的是McManus(1946年)和Hotchkiss(1948年)建立的过碘酸-Schiff反应(PAS反应),可使细胞和组织内的多糖、黏多糖、糖蛋白呈红色;Steedman(1950年)建立了用alcian蓝显示酸性黏多糖和透明质酸的方法;Michaelis等(1945年)发现用甲苯胺蓝染色,可使组织中的肝素等酸性黏多糖呈异染性。
    脂类的组织化学显色法中,除用苏丹Ⅲ外,Michaelis(1901年)、Lison(1930年)和Liliie(1944年)等还发现用苏丹Ⅳ、油红O、苏丹黑等脂溶性染料的染色法。此外,还有用锇酸浸染显示脂类的方法。
    有关酶组织化学的研究从20世纪40年代兴起,至20世纪50年代初已建立了18类酶的数十种显色方法。Takamatsu(高松英雄)和Gomori于1939年同时证明了碱性磷酸酶的组织化学方法,这一年标志着酶组织化学真正开始,以后相继出现了许多酶的显示方法。此时,随着电子显微镜的问世和超薄切片技术的发展,Scheldon等(1955年)首先将超薄切片技术应用到酶组织化学中,在电镜下观察酸性磷酸酶的分布,Brand等(1956年)又用此法观察到碱性磷酸酶存在于溶酶体内,他们的成就使组织化学技术与电镜技术结合起来,从而开创了电镜组织化学的新领域,使酶在细胞中的定位进入到亚细胞水平。
    1941年Coons和他的同事首次用荧光素标记抗体检测肺组织内肺炎双球菌而获得成功,开创了免疫细胞化学的新篇章。为在荧光显微镜下能够对酶进行观察,Coons等人(1950年)提出了荧光抗体法。但是,荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察。为此,Nakane等人(1966年)尝试用酶代替荧光素来标记抗体的方法,从而成功地开创了酶标记抗体的新技术(酶标抗体法)。Sternberger等人(1970年)又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引入,建立了过氧化物酶―抗过氧化物酶(PAP)法,使免疫酶法有了很大的进步。Geoghega(1978年)建立了胶体金标记术,Hsu等于20世纪80年代发明了亲和素―生物素―过氧化物酶复合物法(ABC法)。在此之后.免疫金―银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世。随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进,特别是德国人Kohler和英国人Milstein(1975年)建立杂交瘤制备单克隆抗体技术以来.使免疫组织化学发展到一个新的水平,使免疫组织化学技术在生命科学研究中日益显示出巨大的实用价值。
    近二十年来,相继发现了多种亲和物质?如植物凝集素(1ectin)与糖结合物(glycol conjugate)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal proteinA)与IgG、生物素(biotin)与卵白素(avldin)(亲和素)、激素、脂质与受体等。这些物质是一些有多价结合能力的物质,不但亲和物质之间有高度亲和力,而且可以与标记物如荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白等相结合。Bayer(1976年)将这种利用两种物质之间的高度亲和力而相互结合的反应进行细胞化学检测的技术称为亲和细胞化学(affinitycytochemistry)。亲和细胞化学技术的建立。提高和增加了免疫细胞化学的敏感性和检测范围,是免疫细胞化学的新发展。
    分子杂交(insituhybridization)技术引入免疫细胞化学,是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展的重要标志。Hall(1961年)首先建立了液相核酸杂交技术,开创了核酸杂交技术的研究和应用。Bohon(1962年)设计‘了较简单的固相核酸杂交术。Gall和Pardue(1969年)应用蟾蜍核糖体基因探针与卵母细胞杂交,确定该基因位于细胞核的核仁内,开创了原位杂交组织化学技术的应用。Bauman(1981年)发明了用荧光素标记cRNA探针做原位杂交(FISH术),Brigat(1983年)建立了生物素标记探针术。Boeringer等(1987年)发明了地高辛标记探针,并将药盒投放市场,使原位杂交的应用更安全和简便。1998年,Kononen等首次提出组织芯片(tissuechip)的概念,并很快证实了其应用价值。组织芯片又称组织微阵列(tissuemlcroarray,TMA),它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品黏贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上,形成组织微阵列。在同一反应条件下对组织芯片进行免疫组织化学染色、原位杂交、FISH或原位PCR等,以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。它的最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测,缩短了检测时间,减少了不同染色玻片间人为造成的差异,使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子的测定更具有可比性。组织芯片虽说是一种快速、高通量获取生物信息的好方法,但是由于使用石蜡切片,对那些只能应用于冷冻组织切片的抗体或核酸分子杂交方法则不适合。为了弥补这一缺陷,最近美国又发展了冷冻细胞阵列(frozencellarray),其基本原理与组织芯片相似,但使用的材料是新鲜的细胞系而不是经固定剂固定、石蜡包埋的组织。


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