蛋白质组学

简并寡核苷酸基因混编

1. 引言

直到近来,创建组合文库的最流行的方法是通过引入点突变产生一系列进化序列的递归策略。对于体外进化来说,比起递归突变的方法,重组聚合酶链反应( PCR;基因混编)有着实践和理论上的优势 [ 1〜3] 。该方法通过重组融合多重点突变的序列和野生型的序列,可快速得到合适的突变蛋白。相关家族基因重组通过将这些基因的片段进行混编,重组后利用 PCR 技术,得到新的基因。该方法的 PCR 组装步骤主要是利用同源重组。因为 “交叉点”经常发生在序列很类似的区域,所以这些方法都需要基因之间有相对高的序列同源性。

如果进行重组的序列之间相似性比较低,则主要产生未重组的 “亲本”基因,需要比较费力地寻找发生重组的基因[ 4 , 5 ] 。Kichuchi 等描述过一种利用 “亲本”基因上的特异限制性酶切位点来进行基因重组的方法 [5]。该方法可以使基因发生混编的频率增高。

我们分离到一种嗜热的 β-木聚糖酶,它在纸浆漂白方面有着优越的表现 [6] 。我们希望通过基因突变的方法获得一种更稳定的以及变化最适 pH 情况下的 β-木聚糖酶。我们首先运用易错聚合酶链反应(error-prone  PCR) 和错掺突变,然后进行基因混编,这种方法只能在有限的序列上产生突变,并且需要花费很大精力去筛选
这些突变体。另外,通过 DNA 酶 I 处理的相关家族基因片段,然后进行混编(家族混编),发现主要产物是野生型的序列。为了避免上述情况,通过方法上的改进,我们发明了一种技术,可以使基因重组发生在序列相似性不高和 GC 含量差别很大的片段上,且可以显著减少未发生重组的基因产量。更进一步,可以控制引物延伸的条件,从而使子代基因与亲代基因不同,我们将这种方法称为简并寡核苷酸基因混编(degenerate oligonucleotide  gene shuffling,DOGS;参考文献 [ 7 ] ) ,它也可与其他突变技术一起使用。

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