蛋白质组学

植物过氧化物酶同工酶测定

凡能催化同一种化学反应,但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同工酶(isoenzyme)。同工酶谱的差异是基因表达的差异造成的,所以在研究植物基因调控与生长发育及其与环境条件的关系以及许多生理生化和遗传问题时,常常要分析同工酶谱的差异。因此,同工酶研究在理论和实践中都有非常重要的意义。

一、原理

聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成,具有三维网状结构,其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异,因此在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色,这样就可在凝胶中展现出酶谱。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理,将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色,出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置,多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。本实验利用连续的盘状凝胶电泳,采用Tris-Gly缓冲系统来分离阴离子过氧化物酶同工酶。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料:小麦芽

(二)仪器设备: 1.稳流稳压电泳仪;2.冷冻离心机及离心管;3.成套电泳槽(圆盘型);4.pH试纸;5.其它常规用具。

(三)试剂: 1.分离胶缓冲液(pH8.9):1mol/L HCl48ml,Tris36.6g,TEMED0.23ml,加水定容至100ml。2.分离胶贮液:30g丙烯酰胺,0.8g甲叉双丙烯酰胺,加水溶解并定容至100ml,过滤后使用。3.过硫酸铵溶液:过硫酸铵0.2g,加水定容至100ml制胶时现配现用)。4.浓缩胶缓冲液:1mol/L HCl48ml+Tris5.98g+TEMED0.46ml,调pH6.7,并定容至100ml。5.浓缩胶贮备液:丙烯酰胺10g,甲叉双丙烯酰胺2.5g加水定容到100ml,使用前过滤。6.电极缓冲液:Tris 6.0g,Gly 28.8g,用水定容至1000ml(pH8.3),用前稀释10倍。7.四甲基乙二胺(TEMED)。8.0.1%的溴酚蓝水溶液。9.联苯胺染色母液:联苯胺1g+冰醋酸18ml+H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。

三、实验步骤

1.安装电泳槽

2.凝胶的配制

3.过氧化物酶的提取 称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内,加入1mlH2O或0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6,8)研成匀浆,转入离心管,再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管,3500rpm离心15~20min,其上清液即为酶的提取液,供电泳分析用。

4.点样:用微量注射器吸取上清液,每管加样50μl,再分别加入40%蔗糖溶液5μl,之后再用注射器将电极缓冲液慢慢加入每支胶管至浸没顶部为止.最后向上、下电泳槽倒入电极缓冲液(上槽必须淹没管顶,下槽液要能浸泡着凝胶管),最后在上槽液中滴入1~2滴溴酚蓝溶液。

5.电泳:将电泳槽放至低温处,最好在4℃左右,或接通电泳槽水冷却系统按上“一”下“+”接好导线,通电,电泳开始电流应低,每管1mA,10min后,再加大电流,使每管达到2~3mA,当溴酚蓝指示剂达到距管底约1cm处时,切断电流,停止电泳。

6.剥胶:电泳完毕,将电泳槽取出,倒去缓冲液,取下凝胶管,放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器,吸满水,将针头沿管壁插入,同时慢慢地将注射器中的水推出,并不断转动凝胶管,将凝胶管挤脱出来,也可用洗耳球挤压。

7.染色:取0.5ml联苯胺母液+H2O 9.3ml+0.2ml3%H2O2,混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看到胶条上出现蓝色或棕褐色环,即过氧化物酶带,约十min后用自来水冲洗,这时蓝色带也慢慢变成棕褐色。

8.记录酶谱,并计算各同工酶的迁移率。

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