蛋白质组学

双向电泳溶液配制方法

A. 裂解液 (lysis solution)
       (8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pharmalyte3-10, 40 ml)

  Final concentration Amount
Urea(Fw 60.06) 8M 19.2g
CHAPS  4%(w/v) 1.6g
Pharmalyte3-10 2% 800μl
Double distilled H2   To 40ml

新鲜配制或者分装贮存于-20℃
       ① 如果需要,尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M,也可用 7M Urea,2M Thoiurea。
       ② 其他的去垢剂(如 Triton X-100,NP-40,还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。
       ③ 如果需要,蛋白质酶的抑制剂和或者还原剂可以加入。

B.水化液
       (不含有 IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG   buffer)
       (8M Urea, 2% CHAPS, bromophenol blue,25ml)

  Final concentration Amount
Urea (FW 60.06) 12g 12g
CHAPS 2%(w/v) 0.5g
Bromophenol blue 0.002%(w/v)  50μl
Double distilled H2O   To 25ml

分装贮存于-20℃
       ① DTT和 IPG buffer在用之前加入:每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。如果胶内上样,则样品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。
       ② 如果需要,尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M。
       ③ 其他的去垢剂(如 Triton X-100,NP-40,还有其它的非离子去垢剂23或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。

溴酚蓝储液

  Final concentration  Amount
Bromophenol blue 1% 100mg
Tris-base 50mM 60mg
Double distilled H2O   To 10ml

C. 水化液
       (含有 IPG buffer,Rehydration stock solution with IPG buffer)
       (8M Urea,2% CHAPS,0.5%  or 2% IPG buffer,bromophenol blue,25ml)

  Final concentration Amount
Urea (FW 60.06)  8M  12g
CHAPS 2%(w/v)  0.5g
IPG buffer(same pH range as the IPG strip) 0.5%or 2%(v/v)  125 or 500μltd>
Bromophenol blue 0.002%(w/v) 50μl 1% solution
Double distilled H2O   To 25ml

分装贮存于-20℃
       ① DTT和 IPG buffer在用之前加入:每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。如果胶内上样,则样品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。
       ②IPG buffer 的浓度取决于所用的等电聚焦系统和 IPG胶条的 pH 范围。
       ③ 如果需要,尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M。
       ④ 其他的去垢剂(如 Triton X-100,NP-40,还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。
       ⑤ 浓度为 0.5%的 IPG buffer用 125μl IPG buffer,浓度为 2%则用 500μl。

D.平衡液(SDS equlibration buffer)
(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200ml)

  Final concentration Amount
1.5M Tris-cl,pH8.8(see solution F) 50mM 50mM  6.7ml 
Urea(Fw 60.06) 6M 72.07g
Glycerol(87% v/v) 30%(v/v)  69ml
SDS(Fw 288.38) 2%(w/v) 4.0g
Bromophenol blue  0.002%(w/v) 400μl 1% solution
Double distilled H2O    To 200ml

分装 40ml 贮存于-20℃。这是一个贮存液。用之前在加 DTT或者碘乙酰胺。

E.单体贮存液(Monomer stock solution)
       (30% acrylamide,0.8% N,N!-methylenebisacrylamide,200ml)

  Final concentration  Amount
Acrylamide(Fw 71.08)  30% 60.0g 
N,N`-methylenebisacrylamide(Fw 154.17) 0.8% 1.6g
Double distilled H2O   To 200ml

用 0.45微米的滤纸过滤。4℃避光保存。

F.4x分离胶溶液(4x Resolving gel buffer)
(1.5M Tris-Cl pH8.8, 1000 ml)

  Final concentration Amount
Tris-base(Fw 121.1) 1.5M 181.5g
Double distilled H2O   750ml
HCl(Fw 36.46)     Adjust to pH8.8
Double distilled H2O   To 1000ml

用 0.45微米的滤纸过滤,4℃保存。

G.10% SDS溶液

  Final concentration Amount
SDS(Fw 288.38) 10%(v/v) 5.0g
Double distilled H2O   To 50 ml

用 0.45微米的滤纸过滤,室温保存。

H.10%过硫酸铵(10% Ammonium persulphate)

  Final concentration Amount
 
Ammonium persulphate(Fw 228.20) 10%  0.1g
Double distilled H2O   To 1ml

当加入水时,新鲜的过硫酸铵会发出“咔嚓”声音。如果没有声音,则需要换新的药品。用之前配制。

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