蛋白质组学

硝酸银染色

银染的方法种类很多,目前有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银,沉淀在蛋白质的表面上而显色。

由于银染的灵敏度很高,可染出胶上低于 1 ng/蛋白质点,故广泛的用在 2D 凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后,再通过考染富集该目的点,然后做进一步的肽段指纹图谱分析(PMF)或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展,对银染后的 f mol 级的蛋白质点直接测定已非难事。这里介绍一种可兼容质谱分析的银染方法,实验程序如下:

Step Solution (250ml per gel) Gel Type
固定 25ml acetic acid, 100ml methanol
125ml milli-Q water
1mm
unbacked
2x15 min
1mm on film or glass
support or 1.5 unbacked
2x60 min
敏化 75ml methanol, 0.5g Na2SO3, 17g
NaAc, milli-Q water to 250ml
30 min 60 min
漂洗 250ml milli-Q water 3x5 min 5x8 min
银染 0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml 20 min 60 min
漂洗 250ml milli-Q water 2x1 min 4x1 min
显色 6.25g Na2CO3 , 100μ formaldehyde,
milli-Q water to 250ml
4 min 6 min
终止 3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml 10 min 40 min
漂洗 250ml milli-Q water 3x5 min 2x30 min

银染注意事项:

1. 很多银染程序都使用了戊二醛(glutardialdehyde),它能提高银染的灵敏度和染色结果的重复性,但是因为戊二醛会修饰蛋白质,从而会影响对蛋白质点的质谱鉴定和分析;

2. 保证所有的染色器皿绝对的干净,可使用玻璃或塑料做染色器皿;

3. 水的纯度对染色结果好坏影响是很大的,至少要用双蒸水(导电率<2μS),有条件的可使用 Millipore water;

4. 染色过程中避免手去接触凝胶,必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套;

5. 所用的化学试剂一定是要分析纯 ( AR )。

(0)

热评文章

发表评论