蛋白质组学

DIGE荧光差异凝胶电泳技术特点及应用

DIGE荧光差异蛋白表达分析系统在传统双向电泳技术的基础上,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品,并第一次引入了内标的概念,极大地提高了结果的准确性,可靠性和重复性。在DIGE技术中,每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异,统计学可信度达到95%以上。

荧光染料种类虽多,但用于蛋白质组样品标记的荧光染料不同于普通荧光染料,标记后的蛋白质不应该有等电点上的改变,分子量上的改变也应该保持最小而且不同荧光染料导致的分子量的改变应该一致。用于蛋白质预先标记的荧光染料分为两类,最小标记和饱和标记。其中最小标记荧光染料包括三种,分别是Cy2,Cy3和Cy5。这三种荧光染料化学结构上相似,分子量接近,带有相同的活化基团-NHS脂,可以特异性的标记在赖氨酸残基的ε氨基上,由于三种染料均带有一个正电荷,这样通过取代反应蛋白质的等电点不会发生改变,保证了不同样品中的相同蛋白质可以泳动到相同的位置。不过要注意,过多的染料标记会导致蛋白质的疏水性增加而不易溶解。保持1~2 %的蛋白质的赖氨酸残基被荧光标记修饰,才可以维持被标记的蛋白在电泳时的溶解性,因此,在标记样品时,保证合适的蛋白质和染料的摩尔数比例至关重要。通过调整合适的pH值、合适的染料和蛋白质的摩尔比,可以保证每个蛋白质分子最多只标记上一个染料分子,来保证蛋白质的分子量变化最小。

 

主要特点:

1. DIGE荧光差异分析,用于检测蛋白表达中真实的生物学差异,并对差异进行定量。

2. DIGE技术结合了蛋白质组学研究中经典的双向电泳技术和特有的多重荧光分析技术。

3. 不同的样品分别由电荷和分子量匹配的DIGE荧光标记物预标记,随后再混合并在同一块胶上跑电泳。

4. 常规检测到小于10%的蛋白表达差异而统计学可信度达到95%。

实验流程

1. 为保证实验顺利进行,须对样本进行预实验,以检测甲方提供的样品是否合格。

2. 预实验顺利完成后,进行正式实验,电泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三种荧光染料分别标记蛋白质样品(其中包括一个蛋白质内标),将标记好的蛋白质样品混合,在同一块胶上进行双向电泳,电泳结果分别用3种不同的激发波长得到不同颜色的荧光信号,根据这些信号的比例来判定样品之间蛋白质的差异。DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异,统计学可信度达到95%以上。

3. 质谱分析(包括胶内酶切、串联质谱分析和数据库检索)

4、蛋白点的质谱鉴定:质谱的数据通过MASCOT数据库检索来确定蛋白点所对应的基因

配套设备:

主要应用:

采用DIGE技术,通过对不同类型,不同个体的细胞、组织、或经过不同处理和不同生长条件下蛋白质表达差异分析,在研究疾病的分子机理、分子诊断、药物作用机理、毒理学等方面都有广泛的应用。尤其是通过对各种疾病组织和正常组织进行比较,可以得到针对特定疾病(例如肿瘤)的一些标记蛋白质,得到的这些蛋白质可以用来作为疾病分子诊断的标记,或为进一步的疾病治疗以及药物开发提供有价值的信息。 DIGE是目前蛋白质组学研究中可信度和准确率最高的技术之一,是已经经过验证并且被许多著名的蛋白质组学研究部门肯定的技术。DIGE技术已经在各种样品中得到应用,包括人、大鼠、小鼠、真菌、细菌等,主要用于蛋白质组学,如各种肿瘤研究,寻找疾病分子标志物,揭示药物作用的分子机制或毒理学研究等方面。

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