蛋白质组学

双向电泳操作步骤及相关溶液配置

一、实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤:

1. 样品的溶解

取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70ul,-80℃保存。

2. Bradford法测蛋白含量

取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul 的BSA溶解液,另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul),然后,各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用),摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。

3. 双向电泳第一向——IEF(双向电泳中一律使用超纯水)

3.1 水化液的制备

称取2.0mg 的DTT,用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清。

在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340ul,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清。

3.2 点样,上胶

分两次吸取样品,每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3-10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意:胶条使用前,要在室温中平衡30分钟;加样时,正极要多加样,以防气泡的产生;压胶时不能产生气泡;酸性端对应正极,碱性端对应负极;样品加好后,加同样多的覆盖油(Bio-Rad),两个上样槽必须与底线齐平。

3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20℃)

S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)

S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)

S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)

S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)

S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计44110vhs, 19.5小时

其中S1用于泡胀水化胶条,S2和S3用于去小离子,S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后,在滤纸上吸干(胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸,如果为18cm的胶条要将两头剪去),再以超纯水冲洗,滤纸吸干(再次冲洗过程也可省略),然后用镊子夹住胶条以正极端(即酸性端)向下,负极端(即碱性端)向上,放入用来平衡的试管中(镊子所夹的是碱性端,酸性端留有溴酚兰作为标记),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。

平衡第二次时,在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片,长度与一向胶条的宽度等同,然后吸取煮好的Marker,转入SDS-PAGE胶面上,保持紧密贴合;同样在第二次平衡时,煮5%的琼脂糖10ml.

4. 双向电泳第二向——SDS-PAGE

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

分离胶:(T=8% 80 ml):溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED

30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml

分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul

双蒸水 38.72ml

浓缩胶:(T=4.8% 10ml)

30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml

浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul

双蒸水 5.9ml

4.2 灌胶

将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。

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