蛋白质组学

2D电泳 实验教程 之 第二向电泳

第二向SDS-PAGE电泳 介绍

1.配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。

2.待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。

3.从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。

4.配制胶条平衡缓冲液I。

5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

6.将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

7.配制胶条平衡缓冲液II。

8.第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

9.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶慷宰抛约骸?br>

10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

11.将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

12.第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

13.将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

15.用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

16.放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

18.在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

19.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。

20.进行染色。

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