蛋白质组学

双向电泳实验过程及相关溶液配置

一、实验原理:

2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤:

1.样品的溶解

取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300μl裂解液(1mg蛋白:100μl裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70μl,—80℃保存。

2.Bradford法测蛋白含量

取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的BSA溶解液,另2管中分别加入2μl的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80μl),然后,各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用),摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如:

编号 蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值

1 0 80 4 0

2 5 75 4 0.024

3 10 70 4 0.061

4 15 65 4 0.091

5 20 60 4 0.116

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

转Bt4 2 78 4 0.075

转Bt4 4 76 4

标准曲线方程式:Y= aX+b.其中Y为 OD值,X为蛋白含量。a、b通过作图输入数据可知

相关系数通过输入数据,作图,软件分析可得

OD值测量过程:

比色皿用70%的乙醇保存,待用时用双蒸水冲洗,再用无水乙醇冲洗,双蒸水冲洗,再加入待测样品溶液润洗,然后,加入样品,测定OD值。

3.双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)

3.1 水化液的制备

称取2.0mg 的DTT,用700μl水化液储液溶解后,加入8μl 0.05% 的溴酚兰,3.5μl(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清。

在含300μg 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340μl,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清。

3.2 点样,上胶

分两次吸取样品,每次170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3—10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。

注意:胶条使用前,要在室温中平衡30分钟;加样时,正极要多加样,以防气泡的产生;压胶时不能产生气泡;酸性端对应正极,碱性端对应负极;样品加好后,加同样多的覆盖油(Bio-Rad),两个上样槽必须与底线齐平。

3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20℃)

S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step)

S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时

其中S1用于泡胀水化胶条,S2和S3用于去小离子,S4和S5用于聚焦

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