蛋白质组学

脉冲场凝胶电泳技术

PFGE技术简介

1984年Schwartz和Cantor发明了交变PFGE技术,解决了大片段DNA (>40 kb)差异的问题,同时提高了DNA的分辨力。此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级DNA的能力。这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。

工作原理:大小不同的DNA 分子在交替变换方向的电场中做出反应所需的时间不同,一般较小的分子重新定向较快,在凝胶中移动快;大的DNA分子比小的DNA分子定向慢,在凝胶中移动比较慢;根据各DNA分子迁移距离的不同从而可以达到分离不同大小的DNA 分子的目的。

在所有分子分型方法中,脉冲场凝胶电泳以重复性好、分辨性强,被作为细菌分子分型的PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细菌分子分型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的标准技术。

PFGE 琼脂糖的选择

PFGE是以琼脂糖作为支持介质的电泳方法。不同支持物的PFGE其用途及作用效果不尽相同,依据不同的支持物可以将PFGE分为2种。

1.SeaKem Gold琼脂糖PFGE

SeaKem Gold琼脂糖是一种高凝胶强度,低电内渗(Electric endosmosis,EEO),标准胶凝温度的琼脂糖。

这种琼脂糖最适于PFGE快速分辨50 kb~10 Mb的DNA和常规电泳方法分辨1~50 kb的DNA与PCR产物。因其低EEO特性,SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显著高于常规琼脂糖凝胶,从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片段并减少PFGE中DNA分离的耗时。因此,这种方法比较常用。

2.InCert琼脂糖PFGE

兆碱基片段DNA制备获准使用的琼脂糖,是一种极为有用的制备PFGE用染色体DNA样品的低熔点琼脂糖。研究证实InCert琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制备和限制性核酸内切酶消化。吴利先和黄文祥参照Murray等的方法利用InCert琼脂糖进行PFGE鉴定,并获得sprE基因突变株。

PFGE的应用范围

1. 微生物分子分型;

2. 细胞凋亡的检测;

3. 临床诊断和治疗

4. 耐药菌株流行趋势分析

5. 抗生素敏感株和多重耐药菌株的分子分型,

操作步骤:PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原位裂解、稀少酶切位点的限制性内切酶对染色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染色观察5个步骤。

参考文献:

1. 王丽丽, 徐建国.脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)在分子分型中的应用现状.疾病监测,2006.
2. 刘凯,袁雪姣.肠致病性大肠杆菌分离株的脉冲场凝胶电泳分析.现代预防医,2015.
3. 董栋,商军.脉冲场凝胶电泳技术的应用及其发展趋势.上海畜牧兽医通,2014.
4. 刘志国.崔步云.布鲁菌分子分型方法应用研究进展.中国人兽共患病学,2015.

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