蛋白质组学

核酸凝胶电泳观察法

实验原理:琼脂糖是海藻中提取的线状高聚物,不同浓度的琼脂糖密度不同,一般PCR产物使用2%浓度,0.5Kb-10Kb的DNA使用1%浓度,基因组DNA使用0.3%-0.7%浓度;

不同大小的核酸在同一浓度的凝胶中迁移率不同,因为分子越大其受琼脂糖的阻力越大,迁移率与碱基对的对数值成反比;同分子量不同构象的核酸迁移率也不同,超螺旋环状DNA迁移率〉线状DNA迁移率〉带切口环状DNA迁移率。

荧光染料溴化乙锭可嵌入DNA堆积碱基间,DNA吸收的254nm的紫外辐射与溴化乙锭在302nm和366nm处的光吸收可在590nm处(可见光红橙区)发光,利于观察,用于核酸凝胶鉴定。

一、实验材料

琼脂糖、溴化乙锭(10mg/ml)、6×loading buffer、凝胶电泳缓冲液(1×TAE或0.5×TBE)、电泳仪、电泳槽、微波炉

50×TAE(储存液): 242g/L Tris碱

57.1ml/L 冰乙酸

100ml/L 0.5M EDTA (PH 8.0)

6×loading buffer:0.25% 溴酚兰

0.25% 二甲苯青FF

15%聚蔗糖(Ficoll 400型)(pharmacia)

琼脂糖(promega)

二、实验方法

1.配置凝胶电泳缓冲液,用相应的凝胶电泳缓冲液配置相应浓度的凝胶。

2.微波炉加热使凝胶融化,温度降至60℃左右加入溴化乙锭(终浓度为0.5μg/ml)混匀。

3.将胶倒入槽中至厚度约3-5mm左右,梳子距槽底1-2mm,并去除气泡。

4.倒入凝胶电泳缓冲液,小心拔去梳子。

5.DNA样品与6×loading buffer混匀加入凝胶加样孔中,接上电源,电压降采用1-5V/cm,DNA由负极向正极移动。

6.电泳一般30分钟足矣,可根据溴酚兰和二甲苯青FF的位置延长电泳时间,电泳完毕,UV下观察。

三、注意

1.溴化乙锭是强诱变剂兼有中毒毒性,使用时必须戴手套。

2.不同的DNA样品需不同的电泳方案,需参见文献。本文为一般常用法。

四、参考文献

J.萨姆布鲁克. 1995,分子克隆,P308-313。

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