蛋白质组学

我试过了!喷血推荐blue sliver胶体考染法!

喷血推荐blue sliver胶体考染法!

我做了2D的三块平行胶,一个一般考染,一个blue sliver,一个银染(如图从左到右),
我想不用我多解释什么了吧?!!

愿意喷血向大家汇报这种染色方法的初步尝试结果和经验!!

一、先讲讲本版对这种染色方法的提出和进一步讨论过程:
1、siashq大侠在“请教:2DE考染的困惑”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1253068&sty=1&tpg=2&age=0
中提出银染灵敏度高,但质谱鉴定成功率低;而考染质谱鉴定成功率高,但灵敏度不够;好多地方只接受考染标本质谱。
这也是所有做2D――质谱人的困惑,一些更有意义的蛋白质往往是一些低丰度蛋白质,做分析型2D的银染,发现一些低丰度蛋白质,可是做制备型考染时往往灵敏度不够,检测不到。
之后,yezi0623大侠首先提到“electrophoresis杂志2004年25卷1237页的方法,戏称blue silver!”;然后jnuxz主任大人,为我们提供了全文。可是全文只给了配方并没有给出详细步骤。
siashq大侠通过给作者写信,最终确定步骤为:
fix : 40 % ethanol + 10 % acetic acid 30min;

wash: distilled water 15min * 4change;

staining: (0.12% CBB G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) overnight
destain: distilled water

之后,czlong2008大侠,另开新贴,
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1333143&sty=1&tpg=1&age=0
翻译提供了具体染液配制方法,dodderzhang大侠和dodogougou大侠尝试了SDS PAGE胶的这种染色方法,于是我就心动了!!也想象原文一样做三块2D胶,试一把。
讲心里话,这种方法完全是在本版大家热烈讨论和互相交流之下而成型的,我由衷的感谢丁香园,感谢上面的这些战友。现在我尝试了,而且算是初步做成了,我愿意把我做的步骤、改进和体会介绍给大家。
二、步骤:
原文的步骤见zhaolsina大虾的下面回帖(热心同志,主任加分呀!),另外为什么用G250不用R250zhaolsina大虾也为大家说明了。

1、染液配制:染色液的成份(0.12% G-250, 10%(NH4)2SO4,10% H3PO4,20%甲醇)

100ml H2O+100ml H3PO4(先混匀,产热的)+100g 粉末状(NH4)2SO4(边搅拌,边加)先溶解,然后加入 1.2g G-250 再溶解(其实不能真正溶解),用水定容到800ml ,边搅拌边加入200ml甲醇,终体积1000ml(可保存至少半年)。

2、染色
固定: 40 % 甲醇 + 10 % 乙酸 30min或过夜;

水洗: 去离子水 15min × 4;

染色: (0.12% G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) 过夜

3、脱色: 去离子水至背景清楚

三、经验和体会
1、  关于试剂,我用的G250是fisher原装的,硫酸氨是国产的(没时间买进口的,建议大家用进口的),磷酸、醇是国产分析纯(85%),
2、  关于配液
(NH4)2SO4要边搅拌,边加,否则容易结成大块而且很硬很难溶,就这样也不能完全溶解,好像液体已经饱和了。
G250好像在开始加到硫酸氨溶液时也不能真正溶解,只是形成混悬状态。
到最后加入甲醇之后还要搅拌好久,才可以部分真正溶解。
3、  关于改进之处:
我把甲醇改成乙醇,发现好多考染方法用乙醇替代甲醇,另外我的硫酸氨用的国产的,来不及买进口的,估计进口的效果会更好。国产的好难溶。
4、发现脱色有点难,脱干净背景用水要换5、6次,1。5到2个小时。好像背景还有些发蓝,不能真正脱干净。

5、灵敏度确实有很大提高,不过是否真的能够达到ng级就不知道了。

四、关于后续的酶切(原文):

The gel discs containing the protein of interest were washed twice with 50% ACN + 50% ammonium bicarbonate (5 mM solution),for a minimum of 2–3 h untill full decoloration of the gel. After that, wash twice (10 min each time) in 100% ACN. In-gel digestion was carried out in 100 mM ammonium bicarbonate, 1 mM CaCl2 pH 8.9, 30% ACN, and 12.5 ng/mL (1 mg) sequencing grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA) overnight at 37 C.

五、存在的问题:
1、为什么要先用一部分水溶解硫酸氨和R250,之后再加水和醇?而不是一起加,尤其是水,发现100ml水溶100g硫酸氨好难,多加点水可不可以?

2、用乙醇代替甲醇在这种方法里到底合适不合适??谁有兴趣比较一下?

3、我是拿分析纯85%的磷酸当100%的来配液体的,这样对不对?是否换算之后再配(那样水会加的更少,硫酸氨更难溶)?好像没有纯磷酸,最高85%。

4、  关于脱色遇到的问题,大家有什么实践经验或者高见??

5、siashq大侠也做了三种方法的比较,还有谁做过?或者将来做了,欢迎大家交流经验、讨论下去。

(注:附原文)

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