蛋白质组学

(原创)蛋白质的双向电泳 (请加分)

蛋白质的双向电泳实验方法

第一向(等电点聚焦,IEF)

1)凝胶条的准备

1.以帽凝胶端(2个校准环:4mm和10mm)朝下,将4根玻璃管插入两个凝胶灌注装置的每个托架中,这样玻璃管恰好站在两个分隔室之一的“充填船”上。从玻璃管顶端到玻璃管底端拉入PP线(小心,线不易移动),否则以后将不能用它们将胶溶液拉上来。

2.溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监控凝胶溶液的温度,因为高温下(大于25℃)聚合作用太快。

3.分离胶溶液除气4分钟,在桌子边缘轻弹玻璃管壁,避免产生气泡。

4.融化帽凝胶溶液,除气,步骤同3。

5.用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分离胶溶液中,溶液应小心摇晃,避免氧气进入胶内。

6.将分离胶溶液加到两个凝胶灌注装置的每一个充填船里(每4个管700μl)。所有的玻璃管末端都必须浸没于凝胶溶液中。

7.小心将PP线抽出,将凝胶溶液拉上至23mm的标记。

8.换充填船分隔室。

9.使用一个Gilson移液管,加10μl 0.8% APS到390μl帽凝胶溶液中,轻轻振荡使之混匀。

10. 在两个凝胶灌注装置的每个充填船中的空余分隔室内加入200μl帽凝胶溶液;凝胶溶液应到达17mm的标记。

11. 移去充填船,允许凝胶溶液到达13mm的标记。经过这一步,有空气进入管子底端和4mm标记处。

12. 聚合30分钟后,将PP线抽出,去除凝胶表面未聚合的溶液。在毛细血管口部滴加一大滴去离子水,这样在凝胶的上边形成一个潮湿的室,在凝胶和水滴之间形成一个气泡。用此方法形成一个潮湿的室,随后用Parafilm膜封上帽凝胶一侧。凝胶在室温过夜,可以使之进一步聚合。

制备好的管子如果保存于室温,可以在第二天使用,或最迟在制备好第五天使用。

2)加样

1.将乙二胺加入阴极溶液,除气5min,下槽装阴极溶液。

2.融解Sephadex溶液,加入108mg尿素和10μl两性电解混合液到100mg Sephadex胶中,在涡旋器上充分振荡10~15分钟。

3.从凝胶灌注装置移走凝胶管,把它们插入聚焦槽的阳极部分,仍应看到13mm标记。帽凝胶一端朝上。

4.将阴极溶液加入管子的阴极一边,不要有气泡(事先已除去水)。

5.将聚焦槽的阳极部分安放到聚焦槽的底部,管子必须浸入阴极溶液。

6.除去水,并将加样侧干燥。使用一个伸长的巴斯德移液管或凝胶装填移液管头将水吸去,然后用滤纸条将凝胶表面干燥。

7.融解准备好的样品和覆盖溶液。

8.用凝胶装填移液管头,迅速在胶上覆盖大约2mm厚的Sephadex。

9.用一个凝胶装填移液管头,装入样品(1~15μl),加到Sephadex表面。加样时,尖端必须接触Sephdex表层,样品应小心加入,避免气泡。

10. 使用凝胶装填头,轻轻在样品上加入5μl覆盖液并分层,不要使覆盖液和样品相混合。然后在毛细血管中加入阳性溶液,不要引入气泡。

11. 所剩的阳极溶液加入上槽,用缓冲液覆盖所有的管子。

3)IEF电泳

电泳应分段升高以按下表获得Vh(电压×小时)乘积为1841:

凝胶平衡

1.融解平衡溶液(在IEF结束前1小时)。使用之前,在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。

2.IEF结束后,移去管子中的阳性和阴性溶液。

3.用87%的甘油溶液覆盖帽(cap)凝胶一侧。

4.加5ml平衡溶液到Petri盘。

5.用PP线挤出凝胶:PP线从帽凝胶一侧插入,管子加样一侧浸入去离子水,小心地向下挤出凝胶。与此同时可看到水中的覆盖液的溶解。凝胶被拉出5min后,用水迅速清洗挤压端。然后将管子保持在盛有平衡溶液的Petri-盘子上,整个凝胶被PP线拉到盘子里。每个盘子里可平衡两块胶。

6.室温振荡平衡凝胶10分钟整。

7.IEF之后,如果凝胶并不立刻使用,应倒出平衡缓冲液,并在Petri盘中-70℃保存。-20℃保存导致分辨率降低;液氮保存将破坏凝胶。

第二向(SDS-PAGE)

1)SDS-PAGE胶的制备

1.加热琼脂糖溶液至70℃使之液化。

2.冷却琼脂糖溶液至40℃,保持液态。

3.喷洒70%乙醇清洗玻璃板和隔板,并用Kimwipes刷干净。

4.融解凝胶溶液和APS。

5.将玻璃板夹入夹紧装置,该夹紧装置放在灌装支架的前面狭槽中,这样旋钮对着支架,而“尖角”向上。充分旋转旋钮以使厚的有机玻璃正好对齐后部边缘。这时大玻璃板可以放在有机玻璃板的前面,隔板沿着左边和右边的边缘。

插入小板,用拇指轻压玻璃板和隔板以确使玻璃板位于底部。用钳子夹紧做好的“三明治”,后部边缘出现Newton环说明旋钮已经非常紧了。不要将旋钮旋得过于紧,否则玻璃板会被夹碎。将三明治从支架抽出,用拇指检查玻璃板和隔板是否与底部齐平。

6.在小玻璃板底部起6.9cm处做标记,做为加样得辅助(凝胶长度为6.6cm)。

7.将凝胶“三明治”装置夹到灌装支架上,旋钮向内,“尖角”向上。在有机玻璃板上加压以使凝胶三明治插入小突起下面。

8.将18ml凝胶溶液和1.2ml APS相混合,不要有气泡。溶液必须混匀,不要引进氧气。

9.含有凝胶溶液得容器放在加样槽的后面玻璃板上,这样凝胶溶液可以沿着加样槽从玻璃板流下而没有气泡,分离胶被加到标记处。

10. 迅速用去离子水覆盖凝胶溶液,以利于聚合并使表面平坦。在凝胶一端用一巴斯德移液管防止搅动凝胶溶液,并使水在凝胶表面均匀地分层。60分钟后,凝胶可以用于SDS-PAGE电泳。

2)加样

1.用滤纸条去除凝胶表面的去离子水。

2.将凝胶“三明治”放到电极装置上(旋钮冲外,尖角向上):首先将凝胶“三明治”放到电极装置的上面部分,向电极装置挤压它使下面一部分固定。

3.在平板凝胶表面加IEF凝胶:从平衡缓冲液中取出凝胶条,纵向放到厚有机玻璃板的边缘,尽量使凝胶条与加样槽的边缘靠近。使用小刮勺,将凝胶条轻轻向下推,使之小心的滑入加样槽。凝胶条必须位于SDS-PAGE的表面,没有气泡。

4.使用Pasteur移液管,将加样槽加满40℃的琼脂糖溶液(没有气泡),2分钟后,琼脂糖溶液应凝固。

5.在电极装置装入凝胶“三明治”以后,将BioRad槽注入620ml电极溶液,加溶液的时候避免泡沫和气泡的形成。内槽中电极缓冲液面应到达电极装置中红塑料点的位置。

3)SDS-PAGE电泳

1.在将槽封闭之前,需要确定有机玻璃表面是否干燥,以避免形成“渐进”电流,凝胶表面必须覆盖电极缓冲液。

2.电压必须如下表所示分段升高,电流和功率要调到电源的最大值。电流值如表所述并在每一部内逐渐减小。在给定的时间间隔初始和结束的数值如下表所示:

3.SDS-PAGE结束之后,倒出电极缓冲液,从电极装置中取出凝胶“三明治”。轻微地弯曲隔板,将小玻璃板拉开以取出凝胶。凝胶可以转移到固定溶液中。

4.固定之后,可以采用几种染色方法。

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