蛋白质组学

双向电泳IPG(summer)操作总结

一、样品提取:三氯醋酸—丙酮沉淀法
(1) 在液氮中研磨叶片
(2) 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1 小时)弃上清。
(3) 加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
(4) 上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
(5) 用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。
二、一向电泳(13cm的holder)
(1) 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl
(2) 将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
(3) 去掉胶条的保护膜,胶面朝下,先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中,慢慢下压胶条,并前后移动,避免生成气泡,最后放下胶条平端,使溶液浸湿整个胶条。
(4) 在胶条上覆盖适量的覆盖油,盖上盖子。
(5) 将胶条槽平放于一向仪器上,与水平方向垂直。
(6) 设置仪器的运行参数:
三、胶条的平衡(由一向到二向)
(1) 将胶条放入10ml 平衡缓冲液中(加入10mgDTT)封口,在振荡仪上振荡15 分钟。
(2) 将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中(加入250mg 的碘乙酰胺)封口,在振荡仪上振荡15 分钟。
(3) 用去离子水润洗胶条一秒钟,将胶条的边缘置于滤纸上几分钟,以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳
(1) 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上,然后用琼脂糖封顶,准备第二向电泳.
(2) 设置仪器的运行参数:
五、平板胶的染色
硝酸银染色:(整个操作在摇床上进行)
(1) 固定:25ml的冰醋酸,100ml甲醇,125ml 去离子水,60 分钟。
(2) 敏化:75ml甲醇,0.5(1.57g五水硫代硫酸钠)g硫代硫酸钠(使用之前加入),17g醋酸钠,165ml去离子水=====至250ml,30分钟。
(3) 清洗:用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
(4) 银染:0.625g硝酸银,250ml去离子水,(使用之前配制)20 分钟。
(5) 显色:6.25g碳酸钠,100vl 的甲醛(使用之前加入),250ml 去离子水。
(6) 终止:5%的醋酸(EDTA 3.65g加超纯水至250ml)。 =====凝胶保存于1%乙酸中
(7) 照相分析。
(8) 保存制作干胶。
药品:
提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液:1.5MTris-Cl ph8.8 6.7ml,尿素72.07g ,87%的甘油69ml,SDS 4g,溴酚蓝少许。溶涨液:尿素12g,CHAPS0.5g,溴酚蓝少许溶于无菌水中,总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl,DTT1.5vl/100vl。

制作平板胶:

分离胶的配制方法: 12%
药品/浓度  5%  7.5%  10%  12.5%  15%
丙烯酰胺  6.7ml  10ml  13.3ml  16.7ml  20ml
分离胶缓冲液  10ml  10ml  10ml  10ml  10ml
10×SDS  0.4ml  0.4ml  0.4ml  0.4ml  0.4ml
无菌水  22.7ml  19.4ml  16.1ml  12.8ml  9.5ml
10%过硫酸胺*  200vl  200vl  200vl  200vl  200vl
TEMED*  13.3vl  13.3vl  13.3vl  13.3vl  13.3vl
*在灌胶之前加入

药品配制:

丙烯酰胺单体储液:丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液:Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10%SDS:SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10%的过硫酸胺:0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液:Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml
封胶溶液:SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许

附:蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)
原理:这一方法基于2 考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的 大小计算蛋白的含量。
溶液:
1)Bradford储存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2)Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,可保存数周,但在使用前需要过滤。
3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)
做标准曲线:
取样品即可测量。

注意事项:
1、样品制备,样品制备是做好2-d 的关键,样品中离子浓度不能过大,最好用新鲜的样品提取蛋白质,如果不确定蛋白提取情况,建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题, ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择,根据不同样品选择不同pH值,
4、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度需调整。

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