蛋白质组学

2-D结果分析和解决方法!

2-D结果分析和解决方法
一没有可以看到的清楚的点
可能原因
1 上样量不够
2 由于样品的溶解性太差,使得进入IPG胶条的的样品量不足
3 样品含有的杂质阻止聚焦的进行
4 IPG胶条的方向放反
5 IPG胶条在第二向(水平SDS电泳)中的面放反了
6 检测的方法不够灵敏
7 检测试剂失效
解决的方法
1 增加样品的上样量
2 增加样品的溶解性
3 增加样品的聚焦时间或改变样品的处理方法
4 IPG胶条的尖锐端为酸性末端,应该朝阳极
5 确保IPG胶条有凝胶的一面放置在第二相SDS凝胶上
6 使用其他的检测方法
7 检查试剂的有效期,配制新鲜的染色液
二单个蛋白看起来有多个点或丢失或不清楚或在错误的位置
可能原因
1 蛋白甲酰化
2 蛋白氧化
解决的方法
1任何含尿素的溶液不要加热到30度,因为异氰酸盐,尿素的降解产物,会将蛋白甲酰化,改变蛋白的pH值。
2 溶胀液和平衡液中的DTT可以破坏二硫键。进一步的保护作用包括在进行第二相分离前,用碘乙胺平衡液处理胶条。碘乙胺可以使巯基烷基化来保护剩下的蛋白重新氧化。
三 2-D电泳图的扭曲
可能原因
1 (垂直电泳)第二相凝胶的表面不平
2 (垂直电泳)由于聚合的不完全或聚合的太快或到胶时漏胶造成凝胶聚合不均匀
解决的方法
1 倒胶后立即在胶的表面覆盖一层丁醇
2 凝胶溶液脱气;
通过增加50%的APS或TEMED的使用量使聚合加快;
通过减少33%的APS或TEMED的使用量使聚合减慢;
在灌胶的过程中确保不漏胶
四 横纹的产生或不完全聚焦
可能原因
1 上样前,样品没有溶解完全
2 样品在溶胀液中的溶解性很差
3 干扰成分存在。非蛋白成分的杂质会干扰IEF,导致横纹,尤其是在酸性蛋白区域
4 样品中离子成分的存在
5 样品中存在离子去污剂
6上样量太高
7 聚焦不够,聚焦时间不够长以致没有达到稳定的聚焦状态
8 聚焦过度。如果聚焦时间超过100000Vh 会导致水的电内渗和蛋白的迁移,从而产生水平模糊点
解决的方法
1确保样品完全、稳定溶解
2 增加溶胀液中促溶剂的浓度
增加IPG缓冲液的浓度
3 改变样品的处理方法限制这些污染
将盐离子浓度降低到10mM以下,采取脱盐或稀释的方法。用TCA和丙酮沉淀然后再重悬,是一个更有效的脱盐方法可以去掉脂、核酸和其他小分子。
如果样品的处理不能改变,盐离子浓度的影响可以通过改变IEF的程序来降低。将电压限制到100-150v 2h,然后再进行正常的电压程序,前一个程序可以使样品中的离子迁移到IPGstrip的末端。
5如果在样品中存在离子去污剂SDS,那么其用溶胀液稀释后的最终浓度不能超过0.25%。另外,非离子去污剂存在的浓度可以比其他离子去污剂的浓度高至少8倍,从而确保能将SDS从蛋白中完全去掉。
6 降低上样量
延长聚焦时间
7 延长聚焦时间
8 降低聚焦时间
五整个胶上出现横条
可能原因
覆盖的琼脂糖或平衡缓冲液中存在杂质
解决的方法
配制新鲜的琼脂糖和平衡缓冲液
六纵纹的出现
可能原因
1平衡不完全
2电内渗(水平电泳)
3 第二相的缓冲溶液不对
4 SDS电泳缓冲液中的SDS量不足
解决的方法
1延长平衡时间
2 向平衡缓冲液中加入30%的甘油和6M尿素
将平衡好的胶条上的水吸干
3 配制新鲜的溶液
4 使用0.1%SDS
七点脱尾
可能原因
1银染)装胶的盘子太脏或胶的表面存在颗粒物质。DTT或其他巯基可以恶化这种现象
解决的方法
将装胶的盘子清洗干净
将胶条在DTT平衡后用碘乙胺平衡
八胶底部的有污染点

载体两性电解质染色
解决的方法
使用IPG缓冲液作为载体两性电解质混合物。如果有必要的化降低使用浓度
九胶顶端有污染点
可能原因
(银染)存在核酸
解决的方法
使用Dnase和Rnase消化核酸,但是Dnase和Rnase的蛋白在2-D图上会存在
十胶顶部区域的背景太高
可能原因
SDS电泳缓冲液中存在蛋白污染或电泳装置太脏
解决的方法
使用新鲜的SDS电泳缓冲液
清洗电泳装置
斑竹,我想让更多的人看见,所以发了一个新帖,
希望大家补充!

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