蛋白质组学

论什么才是一个好的 label-free 设计方案?

小课堂又要开始啦

话说 label-free 这个蛋白质组学方法实在是有些尴尬。这个方法有可能是进入组学研究以来方法的鼻祖,现在却面临着不大受待见的境地。

不管是从 pubmed 上搜索关键词还是从项目结果中统计,使用 label-free 的项目数量远低于使用 label 的定量蛋白质组学研究,如现在仍很火热的 iTRAQ、有后起之秀态势的 TMT、或者有高实验要求的 SILAC。

今天我们不谈为什么 label-free 远没有 iTRAQ / TMT / SILAC 这些技术使用率高,今天的主题是怎样设计才算是一个合理的、符合样本要求的、也符合实验目的的 label-free 设计方案?

纳尼,没有方案?没有方案,你怎么做项目?

方案设计的好坏是一个项目开展的根本,根本没有打好,如何去开拓天下?

(在这里我能偷偷诉苦一下吗?有些信任我们的童鞋,不,应该是说信任我们方案的童鞋,竟然拿着我们技术支持辛辛苦苦写出来的方案去别家公司做项目,就这样一声不吭走了!

我们的技术支持小伙伴们在获得销售从前方发回的意向的时候,都一个个奉若圣旨,查文献,和客户电话沟通,电话不行的还要上门拜访,一次不行还要多次,辛辛苦苦写出一个方案,然后就没下文啦!)知识的价值在这里完全没有体现啊!

好吧,我承认我们的方案很好!谢谢认可!

回归正题,一个好的实验方案应该包括:

1) 符合老师的实验要求,特别是对比较方案以及差异蛋白质的要求

2) 以样本量为前提考虑

3) 每个样本应该研究的时长,熟称「机时」

4) 实验重复的设置

5) 生物信息分析的内容

1. 符合老师的实验要求,特别是对比较方案以及差异蛋白质的要求

如果要研究「绝对有无蛋白」,请选择 label-free。如果要研究「绝对有无蛋白」,请选择 label-free。如果要研究「绝对有无蛋白」,请选择 label-free。

在这里主要想讲的就是研究「绝对有无蛋白」,这应该是困扰很多老师的问题,从而会带来部分项目的重做。

差异定量蛋白质组学的两种研究方式「label」和「label-free」,虽然均能得到差异蛋白质,但却并不是都能满足「绝对有无」这个要求的。

label 的方法(包括 iTRAQ、TMT、SILAC)由于受到同位素标签的影响,是不能完全把「绝对有无」的差异蛋白区分出来的。因为这些同位素标签里总有那么一两个调皮的,含量达不到 100% 且无法估算出确切含量是多少!

所以当您要研究「绝对有无差异蛋白质」的时候,请一定要事先跟我们的销售以及技术支持沟通清楚,否则等项目全部完成后就后悔莫及啦!

这里再多提一句,差异蛋白质组学研究的目的是给出最大范围的差异蛋白质(也就是目的蛋白的研究范围),并且给出变化的趋势,而不是给出一个精确差异变化的研究方法,否则还要后期验证做什么呢?没有一个实验是能一次性解决所有问题的。

2. 以样本量为前提考虑

label-free 能更好地帮助您研究那些珍贵样本量的项目。

这个是很好理解的,label-free 由于不需对样本进行标记从而造成损失。当然,样本量充足的前提下,请参考其余几条进行选择。

还有一个样本量的考虑是样本处理时间点的选择。如果研究的不同处理时间点较多(理论是超出 10 个时间点),也得选择 label-free。

为什么是「10」?难道你们不好奇吗?

因为现在市面上商品化的试剂标签最多已能达到 10 标,也就是现在越来越热的 TMT-10 plex。理论上 10 个不同处理时间点内的样本差异研究都可以用 TMT-10 plex。

做个广告:中科,也就是我们,已经开始正式推出 TMT-10 plex 项目。如有咨询的,赶紧来哈 记住小编的热线 021-54665263

3. 每个样本应该研究的时长,熟称「机时」

不同类型样本所给予的上机时间应该是不一样的,主要是根据数据库大小以及最新文献报道的结果。比如,研究对象为人血液样本,现在文献报道里人血液蛋白质组的数目也就 1000 多,1-2 h 的研究机时完全可以 hold 住。

现在市面上的 label-free 基本上都会设置每个样本 1-2 h 的机时,有的公司还会提供每个样本分级后每级 1-2 h 的检测。为每个样本设置 1-2 h,甚至更长的 3-4 h。为什么不提供更多分级、更多分析机时的 label-free 服务,下一个议题会为您提到。

4. 实验重复的设置

请注意,label-free 重中之重的关注点,对结果后续研究或者文章发表有决定性作用的,就是 label-free 里面所表现出来的技术重复性。

请注意,我说的是技术重复性,而不是生物重复性。因为生物重复性不是我们可控的,是由样本本身的生物特性、采样以及样本前处理所决定的。

而技术重复性则是可控并且对 label-free 结果有保障性作用的。虽然没有一篇文献对技术重复性需达到多高有一个硬性的规定,但试想一下,如果技术重复性过低,又怎么能够保证那些「绝对有无的差异蛋白质」是样本本身差异的体现还是由于技术误差造成的呢?

而技术重复性的限制,也可以回复上面一点遗留下来的问题,为什么不提供更多分级、更多分析机时的 label-free 服务?试想一下,如果一个 label-free 有 10 个以上不同处理时间点的样本,每个样本上机 3 或 4 h,那么保证质谱第 1 个小时和第 30 或 40 个小时的稳定性是多么的重要!

用过质谱的人应该会知道,质谱是一个多么调皮的小伙伴!有的人可能会说,我可以跑质谱的过程中停一下,进行一个校正,然后再继续跑后面的样本。其实这个有点风险的,做质谱的童鞋们会知道,今天的质谱和明天的质谱结果非常有可能不一样的!
小编在这里公布一下数据,中科已经可以完成连续进行 100 个小时的 label-free,中间不带停的那种!

想想那些维护 LC-MS 的小伙伴们,每次遇上这种长时间跑仪器的项目,那颗颤抖的心啊

5. 生物信息分析的内容

生物信息是对所得质谱数据进行整理以及进一步的挖掘,通过生物信息分析,会离自己的目标更近一步。不管是自己的平台还是外包的公司都会提供一套常规的生信分析条目。有的老师会追求生信做得越多越好,但仍然在拿到数据后毫无头绪。

其实从文献上可以看,如果是生搬硬套地把这些标准信息分析的内容放在文章里,能发的杂志因子会越来越低。

生物信息分析不是简单的画图,也不是简单的那几个标配的生信分析条目。但千万不要期待任何一家公司能独立帮您做出一份完美的生信分析,并且立刻拿来发表文献的,除非这家公司是专门做生信或者包发文章的。

生信分析是一个媒介,是通过不同的分析、软件、程序的运用,去玩转数据,像拨洋葱一样,一层一层拨开那些假性干扰数据,得到那些真正有价值的。

上海中科秉承着为客户做好每一个项目的宗旨,积极努力地在推进蛋白质组学、修饰组学和代谢组学的发展。您的每一个建议以及反馈我们都会认真对待,希望我们之间能够建立稳定长期发展的合作关系。您的一小步,我们的一大步!

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