蛋白质组学

SWATH技术解决方案及应用

一、SWATH技术简介

SWATH(Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragment ions)是瑞士苏黎世联邦理工学院的 RuediAebersold 博士及其团队与 AB-SCIEX 于 2012 年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术,是 MS/MSALL 技术的一种扩展。以蛋白质组学样品分析中常见的扫描范围 400 ~1200 为例,每 25 Dalton 作为一个扫描间隔 SWATH,每个 SWATH 扫描时间设定为 100ms,那么该扫描范围累计需要 32 个 SWATH(1200-400/25=32),完成一次扫描仅需要 3.2 秒。

与传统的 shot-gun 技术相比,SWATH 采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息。因此,SWATH 技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术,同时也解决了 shot-gun 鉴定较低重复度的缺点。此外,借助先进的 Triple-TOF5600 plus 质谱系统,SWATH 在定量上具有较高的准确度和动态范围。与传统的基于质谱定量方法不同,基于 SWATH 技术的定量方法直接构建二级碎片离子的 XIC,大大增加了定量的准确度和可重现性。

应用 SWATH 采集模式,一次实验即可获得完整的定量与定性结果,无需进行方法优化。它可以采集样品中所有化合物的信息,可以对所有化合物进行追溯、查询和分析。定量方法采用高分辨模式,可以消除干扰,提高选择性,且定量能力可与三重四级杆质谱相媲美。

二、SWATH技术特点

灵敏度高——SWATH 技术继承了 MRM 的数据采集模式,结合高分辨率的 Triple-TOF5600 plus 质谱系统,具有与 MRM 相当的灵敏度;
可重现性高——重复样品间的定量相关性可达到 0.99 以上;
定量准确度高——定量准确度几乎与 MRM 技术相当;
线性动态范围广——定量范围可跨越 4 个数量级;
通量大——一次实验可检测到 2000 种以上蛋白并定量。

三、SWATH 技术应用

1、蛋白质组定量
对细胞、组织或器官中含有的不同时期、不同条件下蛋白表达水平的研究,生物标志物的寻找都需要对蛋白质进行鉴定和定量,蛋白质组定量已成为研究生命科学的主要手段。

SWATH 定量方法基于提取 Transition 峰面积计算出肽段含量,通过肽段含量推理出蛋白质含量的方法。SWATH 定量应用到proteome-wide 水平就产生了 SWATH 定量蛋白组,以此方法为基础可以迅速锁定几个样品间的差异蛋白质(类似于 iTRAQ 定量蛋白质组)。

生物 SWAHT 采集模式,开发了一种新的技术,采用 SWATH 方法也可以做到 6000 个以上的蛋白质的 SWATH 定量(以人HepG2 为例)。

2、蛋白复合体鉴定

在所有生物功能中,蛋白质复合物的功能占主导地位;在所有细胞功能中,蛋白质间的相互作用是最基本的活动。研究蛋白质组相互作用的方法主要有酵母双杂交技术(Y2H)、亲和纯化(AP)、化学交联偶联质谱CXMS)等方法。其中 AP 技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下,能捕捉出特定的蛋白质及其分子伴侣。SWATH 和 TAP 技术联合使用确定蛋白复合体的成分是 SWATH 定量方法最常用的应用之一,目前已经非常成熟。

生物高精度质谱平台,开发了一套从实验到生物信息分析的 AP-SWATH 流程,采用 TAP 技术将目标靶蛋白的相互作用蛋白特异性富集,然后结合具有高灵敏度、高准确度、高通量等特点的SWATH 定量,能够高特异性的准确富集到靶蛋白的特异性相互作用蛋白,实现复合蛋白质的准确鉴定。

3、宿主蛋白(HCPs)分析

由于宿主细胞蛋白(HCP)等污染物会引发病人的不良反应,所以药品中 HCP 的检测和定量分析是必不可少的。从 1997 年开始,EMA(欧洲药品管理局)法规已经要求必须证实药品中已经去除 HCPs。

质谱能够在快速有效分析 HCPs 的同时确保更好的准确度,TripleTOF 系统搭配 SWATH 采集模式分析 HCPs,可以全面、准确定量分析的同时获得 MSMS 信息,一次进样即可完成任意数量 HCPs 的定量分析工作,并在 30 分钟的 LC 梯度内,完成 ppm 级HCPs 的含量测定。

四、信息分析内容

SWATH 参考谱图数据库构建:通过 DDA 模式的扫描结果,谱图数据库构建、全谱鉴定及结果可靠性评估。

SWATH 定量:根据二级碎片离子的全扫描结果实现二级离子的定量;SWATH 结果可靠性分析;差异表达分析;层次聚类;PCA分析等。

蛋白质功能注释:包括 GO 注释、COG 分类和 KEGG Pathway 分析。

差异蛋白功能富集:包括 GO 富集、Pathway 富集。

差异蛋白网络互作:基于 STRING 数据库的 PPI 分析,基于 Cytoscape 的可视化展示。

五、SWATH技术近期发表的相关文献
Quantifying protein interaction dynamics by SWATH mass spectrometry: application to the 14-3-3 system.NM.2013
Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition.NM .2013
Quantitative measurements of N-linked glycoproteins in human plasma by SWATH-MS. Proteomics.2013
Glycoproteomic analysis of prostate cancer tissues by SWATH mass spectrometry discovers N-acylethanolamine acid amidase and protein tyrosine kinase 7 as signatures for tumor aggressiveness. MCP.2014
SWATH™- and iTRAQ-based quantitative proteomic analyses reveal an overexpression and biological relevance of CD109 in advanced NSCLC.JP.2014
Variation and quantification among a target set of phosphopeptides in human plasma by multiple reaction monitoring and SWATH-MS2 data-independent acquisition.Electrophoresis.2014
Expansion of the ion library for mining SWATH-MS data through fractionation proteomics. AC.2014
Quantitative proteomics by SWATH-MS reveals altered expression of nucleic acid binding and regulatory proteins in HIV-1-infected macrophages. JPR .2014
Reproducible and consistent quantification of the Saccharomyces cerevisiae proteome by SWATH-MS.MCP.2015
SWATH enables precise label-free quantification on proteome-scale. Proteomics.2015
Quantitative variability of 342 plasma proteins in a human twin population.MSB.2015
SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications. MCP.2015

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