蛋白质组学

蛋白质组学同位素标记的亲和标签方法

Aebersold和其合作者开发了一种同时对蛋白质组进行鉴定和相对定量的方法,即一种包含在无胶蛋白质组流程中的同位素标记技术(Gygi等,1999)。

他们提出使用一种试剂,这种试剂能够使两种同位素在形式上具有明显的区别,即同位素标记的亲和标签(isotopicallycodedaffinitytag,ICAT)试剂。ICAT试剂的结构包含一个生物素头部、一个连接部分和一个碘激活的羰基基团,这个羰基基团能够特异性地与半胱氨酸侧链反应。重同位素的形态与轻同位素的形态的差别相当于在连接区部分的8个氢原子被8个氘原子取代。

这种方法的设计目的是比较一对生物样品。两个蛋白质样品(细胞状态I和细胞状态Ⅱ)分别单独用d0 ―ICAT和d8 ―ICAT试剂标记,然后混合,并用胰蛋白酶水解。然后将肽混合物送至生物素―亲和色谱柱分析。这一步骤通过分离和对含半胱氨酸残基肽的洗脱来完成对肽混合物的简化。

洗脱步骤与能够进行质谱和串联质谱的仪器偶联。一对不同标记的肽几乎在相同的时间洗脱,可以通过两个距离为8kDa的质谱信号识别出来。因为预计d0 修饰的肽和d8 修饰的肽的电离性质是相同的,所以在每一个肽上都可以完成相对定量。一旦发现一对呈现“差别表达”的肽,就可以明确地进行串联质谱来鉴定此肽。

这种技术产生的数据比MuDPIT方法得到的数据少,能够直接相对定位二元比较的肽。由于14%的真核蛋白质没有半胱氨酸残基,这使得这项技术不适用于这些蛋白质。对于基于2D―PAGE的方法难以处理的小的、大的、酸性的、碱性的和疏水的蛋白质,这项技术与MuDPIT方法比基于2D―PAGE的方法有相似的优势。它们也有某些共同的劣势,如不能获得完全蛋白质的信息、处理过程的信息、翻译后修饰的信息以及混合物中翻译后修饰的蛋白质的相对丰度的信息。

为了整合这项技术和2D―PAGE方法的优势,现在开发了一种新的试剂,这种试剂称为可裂解的ICAT。此试剂可以与用于2D―PAGE的二元混合物的试剂兼容。这种试剂已由应用生物系统公司投放市场。

(0)

热评文章

发表评论