蛋白质组学

质谱蛋白质组学在微生物鉴定中的应用

微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的,自20世纪80~90年代以来,微生物鉴定系统不断发展,自动化程度不断提高,但也是建立在传统的生理生化和基因基础上。无论是微生物鉴定的传统技术还是基于传统的生理生化和基因基础上的自动化仪器技术,它们均需要经过培养繁殖、分离纯化等步骤,然后再根据表型和基因型来进行鉴定,但是由于微生物群落及其生存环境的复杂性,目前自然界中只有极少部分微生物能够在实验室中培养,这严重阻碍了对微生物验明身份即鉴定的研究,也严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。

虽然随着越来越多的致病微生物和模式微生物基因组全序列测定的完成,基于基因组学的技术也应用于微生物的鉴定系统,但要想通过基因序列,按传统的方法彻底研究海量数据的微生物基因的产物仍非易事,从已经完成测序的一些微生物来看,有许多开放读码框架(ORF)无法确定其功能,人们意识到有必要重新回到蛋白质的水平上来研究微生物,这就需要有一种高灵敏度高通量的大规模蛋白质研究手段,于是微生物蛋白质组研究应运而生。

作为蛋白质组支柱技术的MALDI-TOF-MS得到了极大的发展,尤其是为微生物鉴定研发的CLINPROTTM中的MALDIBioTyper系统一经推出,就受到微生物鉴定和分类领域热烈的迎取,在这方面表现突出的当属德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。BioTyper除了被DSMZ用于微生物鉴定和分类的研究外,还被用于微生物种质的质控以及不同微生物系统发生的研究。下面将这种崭新的快速、方便、经济的鉴定微生物菌株的新一代技术作一概述。

基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定和分类中的应用概述

基于质谱的蛋白质组学技术MALDIBioTyper系统在微生物鉴定和分类的应用,可完成三个方面的工作:

①对于一系列已知微生物,可获得MALDI-TOFMS数据库,即建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库;

②对于未知微生物,则制备未鉴定微生物样品,利用MALDI-TOFMS获得质谱数据,再采用提供的软件包,将获得的质谱数据与已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较,以鉴定具有相同或相似质谱数据的已知微生物,再建立未知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库;

③采用提供的软件包工具,可以利用已建立的已知和未知微生物标准蛋白质组指纹质谱数据库用于临床、环境、工业未知样品的鉴定。这方面的工作是在质谱采集谱图后,由BioTyper软件进行微生物如细菌、酵母、真菌等的鉴定、分类和去冗余。

BioTyper分析软件整合了质谱操作功能和鉴定以及分类的功能,研究者可以自定义滤波(Smoothing)处理参数、数据衰减或基线校正,所以所得结果是专业的峰列表。用于鉴定未知微生物的模式匹配是通过比较所产生的峰的列表同含有种和亚种特征谱图信息的谱图库比较而获得。

软件自动产生峰列表并提取代表一个种群的一定数量谱图的典型峰。未知微生物的鉴定是通过将它们独特的峰列表和数据库比较而完成的,由质谱测得的质量和强度相关性产生匹配分值,并用匹配分值来给结果定级。MALDIBioTyper能够通过一个复杂的校正运算对谱峰质量偏差进行校正,从而增加数据库搜索的可信度。在获得峰后,软件可以设定一个公认的起始误差窗口和一个期望的调整结果,在调节范围内将一个新的峰列表校正为一个已知的峰列表,可鉴定偏离了5000ppm的质谱图。对于系统树的去冗余、聚类和产生,BioTyper通过模式匹配计算库中所有主要谱图的相似性,由于这些谱图各自具有独特的谱峰,所以可采用这个相似分值来构建系统树;根据主成分分析,可以对一套谱图进行自动多变量分析,也可获得基于主成分计算基础之上的多种多样的聚类计算和可视化系统树。

基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定和分类中应用的技术路线

蛋白质组指纹图谱法建立微生物鉴定标准库,不是基于微生物的生理生化指标和基因,而是根据微生物的蛋白质组表达谱的比较来进行的,因此更为准确和直接。

采用MALDIBioTyper对微生物鉴定和分类研究的一般工作流程是一个直线性路径(见图4)。它从一个单克隆或其它生物材料开始,可以在几分钟内分析样品。每个样本的自动谱图获取可以在几秒钟内完成,并且可以实现数据向专门鉴定软件的无缝传输。

该操作流程包括以下步骤,即选择未知微生物、取微生物点MALDI靶、产生MALDI-TOF特征峰、BioTyper数据解析、获得鉴定物种。

在用MALDI-TOF质谱测定时,质谱图用MALDI-TOF质谱仪以线性正性模式用最大频率(20-200Hz,依赖于仪器)采集。谱图的测量质量范围是2000-20000Da。谱图自动获取可以用autoExecute软件用激光强度的模糊控制来进行。在microflex、autoflex或ultraflexMALDI-TOF质谱仪上皆可以高度重复的快速测定。

对于MALDI-TOFMS采集的质谱图,需要用软件BioTyper™或者用于FLEX系列的COMPASS™和flexAnalysis™进行分析,才能解读谱图所蕴含的生物学信息,从而进行微生物的鉴定和分类。

基于质谱的蛋白质组学技术进行微生物鉴定和分类的特点

基于质谱的蛋白质组学技术用于微生物鉴定和分类与传统的方法以及现在主要在用的自动化仪器相比,具有以下特点:

操作简单、快速

可将单个微生物菌落或其它生物材料直接加到MALDI样品靶上并使用MALDI-TOF质谱仪进行分析,谱图识别可以在几分钟内完成,且数据评估同测定直接连接。这种简单且唯一的工作流程对于绝大多数微生物的鉴定是足够的,且不需要进行革兰氏染色、氧化酶测试或PCR引物和条件选择。

重复性好

在很宽的条件范围内,MALDIBioTyper方法都被证明是很稳定的。生长培养基的不同组成对峰模式分布影响非常小,如在从4000到12000Da的范围内,几乎没有观察到培养基的影响。同样,细胞的生长状态对峰模式也没有影响,缓慢生长期的细胞与对数生长期、平台期或者死亡期的细胞具有相似的模式。

在标准条件下进行样本制备和测量后,在不同的MALDI-TOF仪器上获取的质谱谱图具有很高的可比性,如在3个不同的仪器上,对同一样本靶测量的谱图实际上是一致的。因此,来自于不同MALDI-TOF质谱仪的谱图可以用来建立真实可靠的数据库。

这种高重复性是建立在对稳定表达的高丰度的蛋白质测量基础上的,如核糖体蛋白质。在很少出现代谢物的2000到20000Da质量范围内,波谱图可被观察到。与活细胞相比,细菌芽孢可以产生明显不同的峰模式,而且这些“芽孢谱图”也具有重复性。

目前,仪器的高灵敏度可以检测到低至100ng或105个细胞。而对于使用AnchorChip™仪器,25ng的生物材料就能满足需求。

准确度高

MALDI-TOFMS获得的蛋白指纹图谱用作模式匹配,匹配分值用作鉴定结果的分级和归类。BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化,这种校正和统计运算保证了鉴定的精确性,目前可鉴定背离了5000ppm的质谱图。蛋白指纹主要集中在2-20kDa受到微生物生长环境和状态影响很小的持续高表达蛋白。

自动化和高通量

采用MALDIBioTyper方法进行微生物的鉴定和分类,一个样品从单克隆到取得结果只需5分钟,1.5小时可以分析100个样品。

基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定中的应用进展

基于MALDI-TOFMS的蛋白质组学技术的细菌鉴定为许多领域提供了比传统方法更为优越的选择,如环境研究、食品和水质控制、微生物储藏的质量控制、兽医和医学诊断。此方法进行样品制备和检测迅速且成本低,尤其适合于常规和高通量使用。进一步的应用领域在于分类学关系的分析研究,MALDI-TOFMS分析可以获得同经典方法相似的系统树,而且其基于各自质谱模式的复杂微生物群落的去冗余特点更提供了新的科学研究能力,如在环境研究和生物多样性调查中,成千上万的微生物都可以很容易的进行分析并作为进一步分析的基础。

在2006年的世界蛋白质组学会议上,ThomasMaler等报道,将小量的细胞、孢子进行灭活处理并点MALDI靶,在分子量从2000到20000Da范围内以线性模式采集谱图,采用Biotyper软件分析谱图并进行模式匹配、去冗余和主成分分析,结果成功的将梭菌属(Clostridia)和杆菌属(Bacillus)进行了鉴定,其后续研究对细菌(G+,G-)、酵母和真菌也进行了成功的鉴定和分类。在2006年4月《Nature》杂志的方法栏目中,ThomasMaler等详细报道了这一快速、可靠的基于质谱的微生物鉴定和分类技术。同样相似的报道,早在2005年,DemirevPA等在《AnalChem》上也报道了采用MALDI-TOF/TOF质谱进行完整细菌孢子种类的快速、高可信度的鉴定和分类研究。

2006年,ManuelJRodríguez-Ortega等在《NatureBiotechnology》杂志上撰文,采用基于质谱的蛋白质组学方法来快速、可靠的鉴定细菌表面暴露蛋白以用于候选疫苗的研究,结果表明,在链球菌(Streptococcus)M1_SF370A菌株中,有68个PSORT预测的表面相关蛋白被鉴定,其中包括了大多数保护性抗原。这些表面暴露蛋白依菌株不同而不同。高致病性菌株M23_DSM2071含有17个蛋白,有15个和M1_SF370相同,在这17个中有14个蛋白也在大肠杆菌(E.coli)中表达,而且在小鼠中具有拮抗M23_DSM2071致死剂量的保护作用。在该研究中,还鉴定了一个新的保护性抗原Spy0416。研究采用的技术策略克服了表面蛋白特性鉴定的困难,对疫苗的发现具有很大的潜在推动作用。

展望

随着系统生物学的蓬勃兴起,组成系统生物学核心技术的蛋白质组学技术也渗透到生命科学研究的各个领域。蛋白质组学的研究对象已涵盖了原核生物、真核生物、动物、植物等,而且由于微生物个体蛋白质种类少,已成为蛋白质组学研究的突破口,并已取得了很大进展,同时提出了亚蛋白质组学、比较蛋白质组学、定量蛋白质组学等新概念,推动了蛋白质组学的发展。

作为蛋白质组学支柱技术的MALDI-TOFMS也得到了长足的发展,并应用于细菌、病毒和真菌中研究致病微生物的致病因子,着重研究蛋白的功能,为寻找药物靶标和研发新的药物奠定基础,虽然同时多用于蛋白质组表达谱的研究,但技术路线皆为二维-SDS-PAGE联合MALDI-TOF-MS分析,而MALDIBioTyper的技术路线则越过了二维-SDS-PAGE步骤,直接将样品点靶,生成微生物的蛋白质组表达谱,所以该技术路线具有简便、快速、准确、自动化和高通量的特点。这种基于质谱的蛋白质组技术MALDIBioTyper的问世,为微生物的鉴定和分类研究提供了重要的工具,虽然该技术的应用时间不长,却已在医学研究领域显示出独特的作用,并初步取得了一些令人鼓舞的成果,具有广阔的应用前景。

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