蛋白质组学

转录分析的5种方法

信号通路,只有一个目的:将细胞的外部信号转换成细胞的内部变化。不管是胰岛素,还是异亮氨酸,抗原还是肾上腺素,它们的终极目的总是如出一则:对转录活性的改变。

这些对于转录活性的影响来自于转录因子与基因的调控区域:如启动子、增强子、沉默子等结合达到的。经典的凝胶迁移滞后试验(theelectrophoreticmobilityshiftassay)已经成为证明某种蛋白能与特定的短基因序列结合的有力方法手段。但是凝胶迁移滞后试验具有速度慢,通量低,不定量和具有放射性的特点。即使完了你还不知道究竟是何种蛋白或者是蛋白的何种基团负责指导体内转录的变化。

为了弄清楚蛋白与基因序列结合的精确位点,需要利用基于抗体的实验。目前已经有了一些方便快捷的分析试剂,可以有力的帮助进行转录研究分析,其中有一些适用于发现型(筛选多种因子),有一些用于证实猜想的。当然这些总是从初期的工作,进入精细进一步的研究工作。

PROTEINARRAYS(蛋白芯片)

Whattheyare:固定的转录因子阵列,利用标记的基因序列或者蛋白质进行探索。

Whattousethemfor:用于发现和证实转录因子的结合位点或者蛋白-蛋白相互作用。

Pros(优点):能提供一种在广泛的因子中检测与特定序列结合的因子。

Cons(缺点):可能会错失一些同源因子和一些转录后的变化。

Thingstokeepinmind:蛋白分析提供了一种在DNA片段中筛选潜在的结合位点的方法。但这种方法缺乏柔韧性,因此只局限于广泛的已研究的因子。

Availablekits:

Panomics的TFProteinArrayIforDNA-ProteinInteractions(48proteins,CatalogNo.MA3505,$863),

ActiveMotif的TransArray(38proteins,twomembranes,CatalogNo.31400,$580)。

MICROSPHEREASSAYS(液相芯片)

Whattheyare:一些微磁珠的集合在一起,每一个能与唯一的因子结合位点偶联。

Whattousethemfor:筛选转录因子的表达

Pros(优点):提供一种广泛相对无偏见的第一次筛选手段,理论上,一次能检测100种不同转录因子。

Cons(缺点):需要特定的硬件设施(如Luminexreader),不能完全的解释哪一种蛋白与哪一种蛋白结合。

Thingstokeepinmind:像RNAse保护试验一样,磁珠系统能定量转录因子保护寡核苷酸不被消化的能力。来自匹兹堡大学医学中心Luminexcorefacility主任AnnaLokshin就表示:“这种微粒方法能得到意想不到的结果,因为它不会受到假说和初步数据的影响”,“通常你会在自己的知识领域里寻找,但是各自的知识领域是受到限制的。”

Availablekits:

Invitrogen的BioSource3-plexTranscriptionFactorAssays(100tests,CatalogNo.LHF2041,$845),

MarligenBiosciences的MultiplexTranscriptionFactorProfilingKit(20-plex)(96reactions,CatalogNo.11954-096,Price$2,899).

CHROMATINIMMUNOPRECIPITATION(染色质免疫沉淀分析)

Whattheyare:来自天然染色质的蛋白质-DNA交联复合物的免疫沉淀,通过PCR或者微阵列来分析。

Whattousethemfor:证实细胞内蛋白质-DNA天然结合的细节。

Pros(优点):是能在体内进行的唯一分析方法,能详细解释蛋白容量的变化。

Cons(缺点):需要一种目的转录因子的抗体。同时ChIP相对于凝胶迁移滞后试验来说,更为复杂和困难。

Thingstokeepinmind:ChIP不能说明白一种特定结合是否是功能性的。因此,我们需要利用转录活化分析方法。ChIP很有用,但是需要与其他技术合用来解决整个难题。

Availablekits:

ActiveMotif的ChIP-IT(25reactions,CatalogNo.53001,$395),

Upstate的EZChIP(22reactions,CatalogNo.17-371,Price$329)。

OLIGONUCLEOTIDEARRAYS(寡核苷酸芯片)

Whattheyare:固定的寡核苷酸结合位点阵列,一般用于探测核提取物和研发某种蛋白的抗体。

Whattousethemfor:筛选转录因子的表达物。

Pros(优点):提供一种相对广泛,无偏见的第一次筛选手段。

Cons(缺点):定性分析,需要进行研究的转录因子对象的抗体。

Thingstokeepinmind:不同的实验中存在着差异

Availablekits:

Panomics的Protein/DNAComboArray(345sites,CatalogNo.MA1215,$1,415),

ArrayItTranscriptionFactorMicroarrays(expectedFall2006,estimatedprice$600-$900)。

ELISA-BASEDASSAYS(ELISA分析)

Whattheyare:基于酶联免疫反应的转录因子结合分析。

Whattousethemfor:定量转录因子的浓度。

Pros(优点):具有快速,定量和高通量的特点。

Cons(缺点):需要目的转录因子的一种抗体才能进行试验。

Thingstokeepinmind:ELISA-basedassays可以比传统的凝胶迁移分析容纳更多的蛋白,并且能将信号放大。具有半定量的特点。

Availablekits:

Clontech的TransFactorSTAT3ColorimetricKit(1x96assays,CatalogNo.631953,$583),

Panomics的HIFELISAKit(1x96assays,CatalogNo.EK1020,$518),

ActiveMotif的TransAMCREBKit(1x96assays,CatalogNo.42096,$585)。

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