蛋白质组学

重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

一、重组蛋白质的诱导表达

1. 挑取转化有质粒的单菌落, 接种于3ml 选择性 LB 液体培养基中,37℃,250rpm/min振摇培养过夜。

2. 次日将培养过夜的菌液 500 μl 再接种于 10 ml(1: 20)选择性LB 液体培养基中,37 ℃,250 rpm/min振摇培养至光密度(OD600=0.6)时,取 1 ml 样本作 为诱导前标本,10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀,-20 ℃ 冻存备用。

3. 加入 1 mol/L IPTG于菌液中,使 IPTG 终浓度为 1 mM,37℃ ,250 rpm/min振摇培养 4~5 小时。取 1 ml 样本作为诱导后标本,同上法收集菌体沉淀, -20 ℃ 冻存备用。

4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0) 重悬,加入等体积的2×SDS上样缓冲液,煮沸加热5 min,SDS 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离, 考马斯亮蓝染色 3 小时后,脱色观察结果。

5. 选取诱导成功的细菌克隆,扩大诱导规模,收集菌体沉淀,于-20 ℃ 保存, 准备做下一步分析及纯化。

二、重组蛋白质的分离纯化 重组蛋白质的可溶性鉴定

1. 将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysisbuffer under native conditions) 中,然后在-80℃低温冰箱中放置 10 min。

2. 冰中解冻。

3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次,每次10 sec,间歇10 sec,电压200-300 V 。

4. 10000g,4℃ ,离心20 min,取上清(为溶液A ) ,-20 ℃ 保存;另将沉淀用同样裂解液 1 溶解(为溶液 B ) ,同样-20℃ 保存,供后继分析使用。

5. 将上述 A 、B 溶液和诱导前后的细菌进行 SDS-PAGE电泳, 考马斯亮蓝染色, 比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A 溶液中,则为 可溶性蛋白;如果是在 B 溶液中,则为非可溶蛋白。

重组蛋白质为非可溶性蛋白(变性条件下)的分离纯化

1. 将菌体沉淀溶于适量裂解液 2 (Lysisbuffer under denaturing conditions)中,室温下搅拌和吹打沉淀,避免泡沫生成。

2. 10000g,4℃,离心 30 min,收集上清液。

3. 将 Ni-NTAAgarose充填柱子,并连接于 Pharmarcia低压液相层析系统,用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTAAgarose,调节 A 280 值至零线。

4. 将适量上清液上样到 Ni-NTAAgarose 柱子中,并用 lysisbuffer 冲洗至 A 280值低于 0.01。

5. 分别用 5~10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2(Washbuffer 1 and2)清洗柱子,直至 A 280 值低于 0.01。

6. 用洗脱液(Elutionbuffer)洗脱重组蛋白质,在 A 280 值监测下,收集出现峰 线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析,最终用0.01×PBS 透析,透 析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白 (BSA)为标准,采用 BIO-RAD 公司蛋白质定量试剂(proteinassay)比色测定蛋白质的含量。

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