蛋白质组学

ICAT 同位素代码标记技术相关资料贴

随着ICAT的技术日趋成熟,它作为一种较新的定量蛋白组学工具越来越吸引着大家的眼球,勿庸置疑它是定量蛋白质组学的方向之一。版面上之前也有过很多的相关讨论,可以说是非常不错,没有看过的朋友可以参考:
1. 由biodna超版发起的ICAT精华贴:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=408757&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0
2. codegreen主任进一步的一些思考和见解:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=429683&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0
3. gougou兄的一些实践经验和大家的讨论:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1641738&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0
4. 在下的推荐两篇比较2DGE和ICAT的文献
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=2037204&sty=1&tpg=1&age=0

下面先简单介绍一下这项技术。Isotope-coded affinity tag ( ICAT) 同位素代码标记技术应用一种含与蛋白质反应基团、乙烯甘油结合区和生物素标记的试剂,这项技术目前主要由美国ABI公司推动。目前,商品化的ICAT试剂可专与蛋白质或肽段的L2半胱氨酸的巯基反应, 所带的同位素标记为含8 个氢原子的(d0) 轻试剂和8 个氘原子的( d8 ) 重试剂。一般的实验步骤是将一个蛋白质样品用轻试剂标记, 另一个样品用重试剂标记, 然后将两个样品混合, 经胰蛋白酶或Lys-C 水解蛋白得到肽片段。混合的样品用抗生物素蛋白亲和层析法分离。这些肽段还可以进一步通过反向毛细管液相色谱和MALDI-TOF或QTOF2质谱进行分析,质谱后得到的相差8Da 的同位素分子质量峰,这些峰的比率可以作为与原样品各个蛋白相关量的测量尺度, 如一对峰相差8 个质量数,则为同一种蛋白质, 由D0和D8 峰的相对强度进行相对定量。由于ICAT在化学结构上相同且在分子量上只相差8 个中子,所以在用MS 检测时相对量的可信性有所提高。同样的, LC-ESI-MS 也可根据重和轻肽段的相对量提供蛋白的定量信息。它无需繁冗的双相凝胶电泳技术, 对低丰度蛋白的直接捕获测定以及可靠性都较以往的检测技术有所提高。它的其他好处和意义在于:
1) 将混合样品(来自正常和病变细胞或组织等) 直接测试;
2) 快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等;
3) 快速找出重要功能蛋白质(疾病相关蛋白质) 及生物标志分子,进而快速用于疾病诊断。
但是这项技术同样有一些不足:
1)ICAT反应集团(MW=570.5)增加了数据库检索的复杂程度,尤其是对于短肽。(这个问题目前通过cleavable tag已经得到改善)
2)没有半胱氨酸或其巯基被修饰的蛋白不会被标记,所以这些蛋白质的变化不会被鉴定。
3)这种方法要获得完整的信息,最重要的是标记必须是特异、完全的,但当前标记的效率是时间依赖性的,很少能达到80%以上。
4)两种试剂标记的多肽有可能在不同的时间洗脱,所以其相对定量的鉴定可能出现误差。

将ICAT 技术和2D 技术结合可克服ICAT技术本身的一些不足。将两种不同的蛋白质样品分别用重ICAT试剂和轻ICAT试剂标记,混合后用2D 进行分离, 而后进行染色、切割、胰酶消化,用质谱进行分析得到图谱,并且可将部分肽段选择出来用碰撞诱导电离(CID) 来评价或搜索相关的数据库。由于ICAT标记后的半胱氨酸在分子量上增加了422Da , 所以减少了电泳时的移动性. ICAT试剂是亲水性的,保证了样品良好的溶解性,但偏碱性的蛋白质的等电点可能有所改变。也有文献报道同时用3 块胶,分别将两个样品标记重ICAT 试剂和轻ICAT 试剂,跑两块含单独样品的胶和一块两个样品混合后的胶,来定量检测转录后修饰出现的蛋白质的同分异构体。
(以上内容部分摘自国外医学卫生学分册2004年第31卷第1期姜楠文章与propeptide 兄贴子)

I. 实验手册部分

ICAT Labelling Procedure
Cleavable ICAT Reagent Sample Preparation Guidelines
Cleavable ICAT Reagent Kit Troubleshooting

II. 幻灯海报部分

ICAT数据分析
各种定量蛋白质组学方法介绍
关于DIGE和ICAT技术的介绍和比较
最新的SILAC技术应用海报
最新的SILAC技术应用海报2
Cleavable ICAT Reagent 评价海报

III. 参考文献部分

1999年发表在Nature的最早的使用ICAT技术的文章
破骨细胞分化过程中的分泌蛋白的蛋白组学分析
2004年发表在MCP上的肺结核杆菌的比较蛋白组学研究的文章
2004年发表在MCP上使用SILAC技术进行定量癌症蛋白质组学研究的文章

IV. 相关链接

ABI官方网站关于ICAT的KIT和Reagent
英国皇家化学学会关于ICAT网页
National Center for Toxicogenomics (NCT) 的资料
Isotope-Coded Affinity Tags (ICAT) Methodology - Flash Animation
(部分链接摘自biodna超版的精华贴)

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