蛋白质组学

多酚氧化酶(PPO)的分离提取

一、原理与目的
多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶,植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成醌,是组织形成褐变,以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用,所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应,因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联,起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌,邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成,色素分子量愈高,颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料,通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关仪器设备的操作使用,以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、材料与试剂
(1)马铃薯(大约每小组100-200g)
(2)试剂:
0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml;固体硫酸铵;0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,0.005MgCL2)配置时配
(3)实验器械与仪器设备:
试管与试管架;烧杯、玻璃搅棒;移液管、滴管等;试剂瓶;透析袋;
过滤纱布;植物组织匀浆器;pH计和pH试纸;GL-20C高速冷冻离心机;
DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、操作步骤
1:粗酶提取:
水果肉组织按1:1(W/V)比例与003M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%聚乙烯吡咯烷酮)混合,匀浆4层后纱布过滤,滤液以6000rpm离心10min,弃除沉淀获得酶提取液。
2:盐析分级沉淀:
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解),然后6000rpm离心20min弃除沉淀;离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解),再以6000rpm离心20min,弃除上清夜,收集粗酶沉淀。
四、实验结果
获得PPO粗酶液。

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