蛋白质组学

等电聚焦电泳(IEF)分离蛋白及测定蛋白质等电点

一、原理
等电点聚焦(IEF)是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展,等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质,当加上电场后,由于两性载体移动的结果,在两极间逐步建立稳定的pH梯度,当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时,这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动,并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带,这时的pH则是该分子的pI,聚焦在等电点的分子也会不断扩散,一旦偏离其等电点后,由于pH环境的改变,分子又立即得到正电荷或负电荷,从而又向pI迁移。因此,这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中,在pI处得以“聚焦”.
二、仪器与试剂
1.材料:蛋白样品
2.试剂:
聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100
电极液:1M磷酸(阳极液)、1M氢氧化钠(阴极液)
固定液:100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml,定容为1000ml
染色液:0.35g考马斯亮蓝R-150溶于300ml脱色液中,加热到60-70℃,加入0.3g硫酸铜。
脱色液:25%乙醇、8%冰乙酸溶于水
样品缓冲液:1%Ampholine 、2%Triton X-100、9M尿素
三、操作步骤:
1, 样品制备:
用IEF样品缓冲液提取待分析样品,如其他缓冲液提取的样品则应透析后,冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后,离心去除不溶杂质。
2,制模具:
洗干净两块IEF专用玻璃板,进行硅化和反硅化处理,两块玻璃板的硅化和反硅化面相对,放上夹条,夹子夹好。
3, 配胶:
胶液组成:6ml胶母液(10%,19/1)
6-8%尿素
1ml Ampholine (pH3.5-10)
60-80ul 10%AP
5 ul TEMED
4, 灌胶:配好的胶迅速灌入模具
5, 电泳:
等胶凝固后,小心揭去上下玻璃板,将塑料垫片底部擦干,小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片,在纸片上加样,盖上盖子,横功率25W电泳,约10min后,暂停电泳,取下纸片,继续电泳约30min,待电流达4mA以下,停止电泳。
6, 表面电极测定蛋白质的pI
7, 固定:取出塑料片,放入固定液中15min
8, 染色:取出塑料片放入染色液中65℃染色,直至条带出现
9, 可脱色至背景消除后干燥保存。
四、结果 (略)
五、注意事项
1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂,它的含量2�-3�较合适,能形成较好的pH梯度。
2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。
3、 过硫酸铵一定要新配置。
4、 所有水用重蒸水。
5、 样品必须无离子,否则电泳时样品带可能走歪,拖带或根本不成带。
6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄,当电流稳定在8mA,电压上升到550V 以上,由于阴极飘移,造成局部电流过大,胶承受不了而被烧断。
核酸技术

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