蛋白质组学

卵清蛋白分离提取

一、实验目的与原理
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中,对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的,而在碱性溶液中较不稳定。
由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。
二、材料与试剂:
1.材料:新鲜鸡蛋2只
2:仪器:抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器
3:试剂:
10%TCA,用固体NaOH调调PH至1.05-1.10,需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M,PH8.0Tris-HCL缓冲液(每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2),50ml
pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液
三、操作步骤
1,取两只新鲜鸡蛋,得蛋清50ml,置于烧杯中,外用温水浴25℃-30℃,在不断搅拌条件下,缓慢加入等体积得三氯乙酸-丙酮(1:2V/V),立即出现大量白色絮状沉淀,加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min,然后在4℃冰箱中放置过夜。
2,次日用布氏漏斗抽滤,得黄绿色清液。
3,边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白,在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收,下部沉淀部分于4000rpm离心5min,收集沉淀。
4,将沉淀溶于10ml无离子水中,对无离子水(50倍)透析4h,换水两次,再对碳酸钠缓冲液透析过夜,4000rpm离心10min ,去除不溶物。

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