蛋白质组学

能不能成为好蛋白,生活环境很重要

和蛋白打了好些年的交到,也多少了解了些他们的脾气,他们有些时候确实敏感细腻,稍有招待不周,就集体罢工、组团报废。不论是纯化的或是混合的,总之让蛋白们高兴地活着是一件很重要的事,通常情况下,这就是说要让这些蛋白不聚结、能溶解而且有活性。那么我们就需要给蛋白营造一个好的生活环境,也就是一个适当的缓冲液(buffer)同模拟生物细胞内部的稳态。在选择一个适当的缓冲液前,有几点是需要考虑的:1)缓冲液的pH;2)缓冲液的种类;3)盐浓度;4)还原剂;5)稳定剂。

pH

一般情况下,蛋白是要待在pH7.4的环境下,目的是模拟细胞稳态以了解蛋白在细胞内的功能。如果你的蛋白在这个pH下是稳定的,那么pH7.4就是个不错的选择。如果他们不稳定,则需要调整缓冲液的pH。一般经验告诉我们,当pH=pI的时候,即pH就是这个蛋白等电位点的值得时候,蛋白不太容易溶解(不知道什么是pI的,自行百度吧>^<)。查pI值的快速方法就是使用ExPASy ProtParam 进行计算(http://web.expasy.org/protparam/)。

缓冲液种类

一旦决定了pH值,接下来第一件事就是选择一个你要用的缓冲液,一定要保证这个缓冲液在所选pH上能够有缓冲能力,所以所选缓冲液的pKa(酸度系数)最好能在所选pH值所代表的酸电离度的附近。第二件事就是确定缓冲液的浓度,一般浓度是50-100 mM,有时候缓冲液浓度不能太高,以免影响蛋白的活性。第三件事就是注意到一些蛋白和缓冲液的特性,比如,磷酸基团会影响到激酶的活性,所以在溶解激酶的时候,要避免使用带磷酸基团的缓冲液,或者要把磷酸基团透析出去;再比如,很多缓冲液的pH是和温度有很大关系的,有时候在常温下配的缓冲液达到了我们想要的pH,但我们把缓冲液保存在4度时或是蛋白反应要在37度,pH变化会很大,最有名的就是Tri 缓冲液,pH会很大程度上受到温度影响。

盐浓度

常用于各种蛋白缓冲液的盐自然是NaCl,使用盐的目的是让蛋白质更容易溶解在缓冲液里,同时模拟蛋白生活的生理环境(physiological conditions of cells)。小编一般用150 mM NaCl在蛋白缓冲液中,但是根据情况的不同,盐浓度是可能会改变的。比如说不同阶段的蛋白纯化步骤,就像用离子交换柱纯化特定蛋白的时候,我们总归是先用低盐的缓冲液把蛋白输送进虑柱,而使用高盐缓冲液滤出蛋白。升高盐浓度是十分容易的事情,即配比缓冲液时多溶些盐;降低盐浓度,则通常使用透析的方法。

还原剂

如果目标蛋白含有半胱氨酸(cysteine)这样的氨基酸,那么防止-SH基团被氧化而导致的蛋白聚合是十分必要的。那么我们的缓冲液中要按情况添加一定浓度的还原剂。常见的还原剂有DTT(Dithiothreitol)、TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)或者2-mercaptpethanol(BME)。TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)是这三种中最稳定也是最贵的。实验室里常见的是DTT和BME这两种,小编一般会把这些还原剂的浓度保持在5-10 mM左右(基本上是要比蛋白浓度要高的)。由于DTT和BME,小编一般是配置无还原剂的缓冲液,等到要用的当天,把储存在冰箱里的DTT或BME按一定比例配比到缓冲液里。特别要注意的是,在某些蛋白纯化的时候,一定要查看所用虑柱是否可以接受这些还原剂,比如说镍柱(His-tag亲和纯化)就会被高浓度的还原剂还原,虑柱颜色由蓝变绿,导致虑柱失活。

稳定剂

一般来说,除了上面提到的四种元素外,我们还可以向蛋白缓冲液中加很多东西,去帮助提高蛋白这种缓冲液中的溶解度和在稳定性,小编就统称这些东西为稳定剂。稳定剂的种类、多少等等都要依情况而定。举几个例子,加入BSA(bovine serum albumin)有时候确实可以稳定住其他蛋白;有时候,通过加入甘油(glycerol)或PEG(polyethylene glycol)增加缓冲液粘稠度,确实可以增加蛋白的稳定性;有时候甚至可以加入一些清洁剂/去污剂(e.g. Triton 或者Tween),也会增加稳定性。

如何配置适合的蛋白缓冲液,需要我们在实验室不断尝试,并且依照情况灵活改变的。有什么关于配置蛋白缓冲液的想法,欢迎留言讨论哦!

文中出现的一些物质的结构

2016032801

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