蛋白质组学

蛋白质组技术

一、研究材料
1995年,Wasinger等在第一篇蛋白质组研究文章中研究的对象为目前已知最小但能自主复制的原核微生物——支原体Mycoplasma genitalium。1996年,研究对象即扩展到单细胞真核生物——酵母以及人体正常组织及病理标本[28],进而突破了早期人们普遍认为的“蛋白质组研究只适用于基因组计划已完成的生物”的界限。因此,1997年,研究对象一下扩展到14种生物,其中虽然绝大多数为原核生物,但也包含多细胞真核生物如线虫。近4年来,蛋白质组研究对象已无任何限制:无需基因组计划完成(当然完成者更好),无原核生物/真核生物、单细胞/多细胞、组织之分。

二、研究范围
“蛋白质组”不仅其研究已成为具有重大战略意义的科学命题,而且其分析已成为一种十分有效且应用广泛的研究手段。正因如此,蛋白质组的研究与分析其范围在短时间内即扩展到令人惊诧的程度。据不完全统计,目前至少已涉及如下方面:①蛋白质,如蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体(isoform)比较;②基因,如功能基因组计划、基因产物识别,基因功能鉴定、基因调控机制分析;③重要生命活动的分子机制,包括细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调节、物种进化等;④医药靶分子寻找与分析,靶分子类型包括新型药物靶分子、肿瘤恶性标志、人体病理介导分子、病原菌毒性成分。由此不难看到,“蛋白质组”研究与分析已涉足生命科学中一系列热点领域。
蛋白质组作图是早期蛋白组研究的主要领域。经过最初三年的努力,在1995年已测定10种蛋白质组图(2-DE)的基础上,又测定了11种生物或组织的蛋白质组图,其中3种生物(线虫、豆科植物根瘤菌属、Ochrobactrum anthropi)蛋白质组图超过1600点,3种蛋白质组图(大肠杆菌、盘基网柄菌、人正常组织与病理组织)建立数据库并上互联网;各类生物中第一个完整的蛋白质组数据库(YPD)完成,含6021种蛋白;提出“蛋白差异显示”概念,并用于环境应激、基因突变、病理进程等研究;建立“proteomic contig’方法,进而使蛋白质组图分辨率提高10倍;提出“蛋白连锁图”(proteinlinkagemap)概念,改进双杂交系统,用于蛋白质组相互作用网络的分析;联合液体自动取样器与LC/ES-MS技术,使蛋白质鉴定速度达20点/日;建立2-DE中糖蛋白与膜蛋白微量鉴定方法;建立“Streamlined样品处理”胶转膜技术,突破了大规模蛋白测序与氨基酸组成分析这两个严重影响蛋白质组分析中蛋白质鉴定的限速步。

三、研究技术

(一)双向电泳的基本步骤
1、样品制备 大体包括蛋白质的溶解、变性及还原、去除非蛋白质杂质等。
2、 第一相等电聚焦 目前,第一相等电聚焦大多采用Amersham pharmacia Biotech公司的
IPGphor或Bio-Rad公司的 仪器 。通常采用的胶条厚度为0.5mm,宽3mm;pH范围通常有3-10、4-7、6-11几类,上样量可达毫克级。
3、第二相SDS-PAGE
4、蛋白质的检测电泳后胶上蛋白质的检测有多种方法,灵敏度和分辨率有一些差异,可根据
上样量、分析要求等加以选择。
主要的方法有:染色法(考马斯亮兰染、银染、铜染)、 同位素 标记、 抗体 标记、荧光标记(荧光桔、荧光红等)。

(二)不同pH分离范围的IPG干胶条
宽范围胶条
pH 3 – 10, pH 3 – 12
窄范围胶条
pH 4 – 7 , pH 6 – 11, pH 5 – 8
甚至可以限定到一个pH单位

四、研究路线

 

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