蛋白质组学

猪免疫球蛋白G2a(IgG2a)酶联免疫分析

免疫球蛋白G 2a(IgG2a) 酶联免疫 分析( ELISA

试剂 盒使用说明书

本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定猪血清,血浆及相关液体样本中 免疫球蛋白G 2a(IgG2a) 含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 免疫球蛋白G 2a(IgG2a) 水平。用纯化的 IgG 2a(IgG2a) 抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入 免疫球蛋白G 2a(IgG2a) ,再与HRP 标记的 IgG 2a(IgG2a) 抗体结合,形成抗体- 抗原 - 酶标抗体复合物 ,经过彻底洗涤后 底物TMB 显色。 TMB HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 免疫球蛋白G 2a(IgG2a) 呈正相关。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度( OD 值), 通过标准曲线 计算样品 免疫球蛋白G 2a(IgG2a) 浓度。

试剂盒组成

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1

1

封板膜

2片( 48

2片( 96

密封袋

1

1

酶标包被板

1 ×48

1 ×96

2-8℃保存

标准品: 135 μ g / ml

0.5ml× 1

0.5ml× 1

2-8℃保存

标准品稀释液

1.5ml× 1

1.5ml× 1

2-8℃保存

酶标试剂

3 ml× 1

6 ml× 1

2-8℃保存

样品稀释液

3 ml× 1

6 ml× 1

2-8℃保存

显色剂A

3 ml× 1

6 ml× 1

2-8℃保存

显色剂B

3 ml× 1

6 ml× 1

2-8℃保存

终止液

3ml× 1

6ml× 1

2-8℃保存

浓缩洗涤液

20ml × 20 倍)× 1

20ml × 30 倍)× 1

2-8℃保存

样本处理及要求

1. 血清:室温血液自然凝固 10-20 分钟,离心 20 分钟左右( 2000-3000 / 分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 / 分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右( 2000-3000 / 分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 / 分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS PH7.4 ),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 / 分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可 将标本放于 -20 ℃保存,但 避免反复冻融 .

7. 不能检测含NaN3的样品 ,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP )活性。

操作步骤

1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10 孔,在第一、第二孔中分别加标准品 100 μ l,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50 μ l,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取 100 μ l分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50 μ l,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l弃掉,再各取 50 μ l分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六, 孔中分别加标准品稀释液 50ul ,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取 50 μ l分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50 μ l,混匀后从第七、第八孔中分别取 50 μ l加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50 μ l,混匀后从第九第十孔中各取 50 μ l弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50 μ l,浓度分别为 90 μ g/ml 60 μ g/ml 30 μ g/ml 15 μ g/ml 7.5 μ g/ml)。

2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、 待测样品孔 。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μ l,然后再加待测样品 10 μ l(样品最终稀释度为 5 倍)。 加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁, 轻轻 晃动 混匀

3. 温育:用封板膜封板后置37 ℃温育3 0 分钟

4. 配液:将30 48T 20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 48T 20 倍)倍稀释后备用。

5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体, 甩干 ,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶标试剂50 μ l,空白孔除外

7. 温育:操作同3

8. 洗涤:操作同5

9. 显色:每孔先加入显色剂A50 μ l,再加入显色剂 B50 μ l,轻轻震荡混匀, 37 ℃避光显色15分钟.

10. 终止:每孔加终止 50μl ,终止反应 (此时蓝色立转黄色)

11. 测定:以空白空调零, 4 50 nm波长依序测量各孔的 吸光 度(OD 值) 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

注意事项:

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

2. 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出,稀释时可在水浴中加温助溶 ,洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数( n 倍)后再测定,计算时请最后 乘以 总稀释倍数( ×n×5 )。

5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6. 底物请避光保存。

7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。

计算

以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,

在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD

值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以 稀释

倍数 ;或用标准物的浓度与OD 值计算出标

准曲线的直线回归方程式,将样品的OD

代入方程式,计算出样品浓度,再乘以 稀释

倍数 ,即为样品的实际浓度。

(此图仅供参考)

试剂盒性能:

1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。

2.批内与批见应分别小于 9% 11%

保存条件及有效期:

1.试剂盒保存: 2-8

2.有效期: 6 个月

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