蛋白质组学

Western bloting 技术

一、实验目的与原理
Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法,由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭,靶蛋白与第一抗体的反应,结合靶蛋白的一抗和二抗的反应,显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上,用其他蛋白作为封闭液,将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭,加入与检测蛋白特异性的第一抗体,经免疫反应,一抗与靶蛋白结合,经洗膜液洗涤后,膜上仅在靶蛋白上结合抗体。在加入与第一抗体有免疫特异性的二抗,使之与一抗反应,反应后,经洗膜液洗涤,二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体,通过酶标反应,在显色液中,膜上结合靶蛋白―一抗―二抗的位置即将呈现一定的颜色。
二、材料与方法
1.材料
从微生物细胞中提取的多酚氧化酶(PPO):10μl,20μl
NC膜:硝酸纤维素膜
2.仪器:
电转移槽,电泳仪,塑料封口机,摇床
3.试剂:
转移缓冲液:48Mm Tris,39mM甘氨酸,0.037%SDS同时加入20%乙醇。
封闭液与稀释液:PBS(牛血清白蛋白)
辣根过氧化物酶显色液:现配现用
三、操作步骤
1.SDS-PAGE电泳见上个实验
2.电转
⑴剪NC膜大小、滤纸与凝胶板一致,浸泡在转移缓冲液中5min。
⑵在转移装置中依次将三层滤纸、凝胶、滤纸、三层滤纸放在一起。
⑶将装好的转移装置放入电转移槽中NC膜一侧向正极,凝胶一面向负极。
⑷接通电源电压63V,电流90mA,转移过夜。
⑸转移结束后,取出装置,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿做标记,切下其中一个孔所对应膜的一半。
⑹NC膜的封闭:将NC膜放入一塑料袋中,加入封闭液3ml,封口,轻轻震荡2h。
⑺将封闭好的NC膜放入另一塑料袋中,加入用封闭液稀释的一抗,2.8ml,封口。4℃下轻摇2h。
⑻洗膜:弃去反应液,用一抗稀释液洗三次,每次10min。
将膜从PBS中取出转至150mM氯化钠,50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min。
⑼将二抗用二抗稀释液稀释,将NC膜放入塑料袋中,加入二抗溶液2.8ml。封口,轻轻震荡1h。
⑽洗膜:取出膜转至150mM氯化钠,50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min,三次。
⑾将膜放入显色液中,室温轻轻摇动,10min。
⑿待条带出现后,立刻用水洗膜,然后转入PBS中,观察记录。

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