蛋白质组学

HIV-gp41原核表达

为什么HIV-gp41与原核PET28a质粒构建后,行诱导表达,SDS-PAGE无结果,而WB却有结果,这种情况怎么回事?(构建后测序同源性达95%,而且已酶切认证构建成功) 谢谢

“SDS-PAGE无结果,而WB却有结果”是什么意思,你表述清楚一点,要不人家会有疑惑的。其实这主要看你是否诱导成功。个人认为还有就是你在原核里面表达,作为包涵体存在形式,你是否将蛋白提出来了呢?

首先,我有点疑问,为什么你构建后测序同源性达95%?这个同源性怎么理解呢?一般测序应该是100%的和原序列相同的吧?至少在预测的蛋白质序列上要100%和原序列相同。要不然很难说明问题。再说了,你有没有排除掉你现在这个序列中是否含有终止密码子呢?

SDS-PAGE无结果,而WB却有结果。不知道你的样品是怎么处理的?如果是直接那细菌用sample buffer来裂解的话,那么可能一个可能是蛋白的表达量太少,考马斯亮蓝染色检测不到。这种情况下可能要检查一下你的序列会不会出现什么问题。或者试一下改变表达的条件:温度,IPTG,菌株等等,来提高蛋白表达量。另外一个可能就是蛋白形成包涵体。如果是用裂解液裂解离心后取上清去跑胶的话,那么也有可能是形成了包涵体,可以考虑改变表达的条件看能不能使之变成可溶解的,要不然就试着从包涵体中提取蛋白吧。

我的建议是:

1: 重新再检查一下你的序列。确保万无一失,要不然到最后才发现是序列有问题的话,那才是够郁闷的。

2: 表达的时候,建议细菌进行裂解后,离心分别收集上清和沉淀分别跑胶,进行考染和WB,看看到底是什么情况。最好能加上一个阳性对照,这样才能说明问题呀。

通常表达量低的时候,PAGE是看不到的,但WB则可能阳性。

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