蛋白质组学

WB实战指南(四)之 难点:抗体孵育

抗体孵育——WB真正的难点:抗体的使用是一种艺术,一种抗体一个脾气。

对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术,高效和低效之间往往只有数倍的差异,而抗体的效价可以差数千倍以上;同样,正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗,谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。

封闭最短可以缩减到5min:

很多人把高背景或者黑板,认定为封闭不充分,其实这也是没有吃透WB(说实话,经常看到坛子上很多人这样给人答疑,非常的无语);实际上封闭(极端点)也是个可有可无的步骤,真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。当你的抗体使用次数较多时,基本不用封闭也可以有较低的背景;如果抗体很新,其实封闭最短可以缩减到5min(没试过更短的,不一定不可以)。那什么导致高背景甚至黑板呢?抗体的质量不太好(主因),或者抗体稀释液的配方有问题(增大抗体稀释比略微有所改善)。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同,也可以不同;通常封闭液是最简单(单方)的抗体稀释液,而抗体稀释液可能是复方。

封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中,milk颗粒未完全溶解时,微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。

紧接封闭操作的是抗体孵育,之间不要用TBST漂洗。抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量,包括抗体的效价和背景的强弱,然而历来商品化的抗体质量参差不齐。各家生产的抗体中质量问题最严重的是scbt的抗体,但它们的价格却是最便宜的。其实,scbt在美国的售后服务还是相当不错的,只要按他们的要求操作仍然能举证抗体的质量问题,可以更换、交换(你指定的他们销售的另外一种抗体),有时候还会附送一些ProA beads之类的,所以不奇怪它的普及率;也正因为此,如果你参考文献的话很容易找到这家公司的。可惜,在国内代理商不可能提供相应的服务,因此购买他们的商品存在不小的风险。

所以,通常我更推荐sigma和Abcom、R&D等。诸如Sigma公司销售的Actin,cat. A5316,clone AC-74,Mab更是作为新手练习专用的抗体;它的背景很低,效价很高,可以1:30,000稀释(是普通一抗效价的30倍)。此外,尽管cell signaling是做磷酸化抗体起家的公司,但它们的抗体的质量总体感觉也不好,所以有其它公司可以选择时,我们会刻意避免购买cell signaling的产品,诸如Akt总抗和Ser473(这两种抗体R&D的产品效价不错)。

(特别注明:前几年CST的AKT抗体识别的条带在55KDa左右,而其他公司均认定为60KDa;最近还有战友提问这个抗体,重新检索了一下,应该是原AKT抗体(包括磷酸化)已经被CST自己下架了,从目前的几个抗体示意图看,大小也已与其他公司一致;因此,要不要买取决你自己)

抗体公司在出售抗体的时候,在广告上会玩很多花样。A.不给整张膜标记的图示。很多抗体质量不好,背景高杂带多,如果靶蛋白区域较干净时,他们通常只给很窄的一条靶蛋白区域的图例。B.不给内源性蛋白标记的图示,用IP的样品取代。通过IP可以富集抗原,减少杂蛋白,通常很容易拿到背景很干净,信号很强的图例。C.用制备抗体时高表达的多肽做阳性样品,不给全长蛋白的图例。由于多肽可以IP富集,且不存在空间折叠的问题(通常裸露在外),因此很容易标记。除以上花样外,不少抗体用途上还有局限,因此挑选抗体时要睁大眼睛。

此外,有一点值得注意的是,scbt销售的抗体表面上很多(通常1ml,而别的公司通常是200ul或者100ul),然而实际上它的浓度也仅为0.2耄允导噬纤强固宓闹柿恳埠推渌镜拿磺鸲际?200ug(常规)。所以在早期,我一直强调如果固定即用型一抗的浓度(稀释的一抗)为1ug/ml时,scbt的抗体最佳稀释比为1:200。不过近来发现,实际上他们的抗体1:2K稀释效价也不错,因此也许其他公司的一抗可以进一步提高稀释比。现在判断当时scbt抗体之所以采用1:200稀释,实际上是因为自制的ECL不够灵敏,所以建议用灵敏性更好的ECL,这样可以减少抗体的消耗量,进一步降低实验成本。

一抗通常4度过夜,效率较常温1-1.5hrs高;二抗通常1:5K稀释,室温0.5-1hr(过久并不会明显提高信号强度甚至会减弱(相当于洗膜),同时造成高背景进一步影响特异与非特异荧光信号强度间的对比。孵育时间过久还会迫使你延长TBST的时间,这对抗原识别能力较弱的抗体更致命)。洗膜通常用TBST,也可以考虑高盐洗膜液(NaCl 0.5M);洗膜时间一般10min*3或者5min*4。抗体孵育和洗膜时,摇床速度不能过快也不宜过慢,需要简单摸索一下。

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