蛋白质组学

酶工程

人们早就知道,在催化化学方面,就其经济性、效率以及用途的多样性而言,很难有其它的化学物质能超过生物酶。如今,生物酶已被广泛用于人类生活的许多方面,如食品、饮料、医用药品、化学工业及洗涤剂的生产等。然而,这些由数百个氨基酸按一定的精确顺序连接起来的生物大分子,其用途是有局限性的。因为,天然酶虽然在生物体内能发挥各种功能,但在生物体外,特别是在工业条件(如高温、高压、机械力、重金属离子、有机溶剂、氧化剂、极端pH等)下,则常易遭到破坏。除这些酶的不稳定性因素外,天然酶还有分离纯化难,成本高,价格贵等缺点。因此,尽管已被发现的酶有数千种,但是目前在国际工业上和研究中商品酶的种类也仅数百种。所以,人们很自然地想到能否运用迅速发展的生物技术来改造天然酶,使其能够适应特殊的工业过程;或者设计制造出全新的人工酶或人工蛋白,以生产完全新的医用药品、农业药物、工业用酶和天然酶不能催化的化学催化剂。

酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。酶工程主要采用两种方法。一是化学酶工程,即通过对酶的化学修饰或固定化处理,改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本,甚至通过化学合成法制造人工酶;另一种是生物酶工程,即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因,从而声查性能稳定,具有新的生物活性及催化效率更高的酶。因此酶工程可以说是把酶学基本原理与化学工程技术及重组技术有机结合而形成的新型应用技术。

目录
化学酶工程
生物酶工程

化学酶工程也可称为初级酶工程,是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究与应用。

1.天然酶

工业用酶制剂大多是通过微生物发酵而获得的粗酶,价格低,应用方式简单,产品种类少,使用范围窄。例如洗涤剂、皮革生产等用的蛋白酶;纸张制造、棉布退浆等用的淀粉酶;漆生产用的多酚氧化酶;乳制品中的凝乳酶等。天然酶的分离纯化随着各种层析技术及电泳技术的发展,得到长足的进展,目前医药及科研用酶多数是从生物材料中分离纯化得到的。

2.化学修饰酶

通过对酶分子的化学修饰可以改善酶的性能,以适用于医药的应用及研究工作的要求。化学修饰的途径,可以通过对酶分子表面进行修饰,也可对酶分子内部进行修饰。主要方法有:

①酶功能基修饰:通过对酶功能基的化学修饰提高酶的稳定性和活性。例如将 -胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH,可使酶抗不可逆热失活的稳定性在60℃时提高了1000倍。

②交联反应:用某些双功能试剂能使酶分子间或分子内发生交联反应而改变酶的活性或稳定性。例如将人 -半乳糖苷酶A经交联反应修饰后,其酶活性比天然酶稳定,对热变性与蛋白质水解的稳定性也明显增加。若将两种大小、电荷和生物功能不同的药用酶交联在一起,则有可能在体内将这两种酶同时输送到同一部位,提高药效。

③大分子修饰:可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇等可修饰酶蛋白侧链,提高酶的稳定性,改变酶的一些重要性质。如 -淀粉酶与葡聚糖结合后热稳定性显著增加,在65℃结合酶的半衰期为63min,而天然酶的半衰期只有2.5min。

3.固定化酶

固定化酶(immobilized enzyme),是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物,反应完成后,容易与水溶性反应物分离,可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点,且比水溶性酶稳定,可较长期使用,具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶,作为生物体内的酶的模拟,可有助于了解微环境对酶功能的影响。

固定化酶在文献中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、结合酶、固定酶、酶树脂及载体结合酶等名称。

酶的催化反应依赖于它的活性部位的完整性,因此在固定某一酶时必须选择适当条件,使其活性部位的基因不受影响,并避免高温、强酸及强碱等条件,不使蛋白质变性。

①载体结合法:最常用的是共价结合法,即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括:氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团,不能是酶表现活力所必需的基团。

②交联法:依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构,使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

③包埋法:酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞,制成固定化细胞,例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体,工业上用于生产6-氨基青霉烷酸。

酶经过固定化后,比较能耐受温度及pH的变化,最适pH往往稍有移位,对底物专一性没有任何改变,实际使用效率提高几十倍(如 5 -磷酸二酯酶的工业应用)甚至几百倍(如青霉素酰化酶的工业应用)。

固定化酶的形式多样,可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产;或在反应器中进行批式搅拌反应;也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学;又可制成微胶囊酶,作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜(包括细胞、组织、微生物制成的膜)与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器,用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。最常用的是酶膜与离子选择电极组成的生物传感器,例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成,脲经脲酶分解成氨及二氧化碳,氨又继续被硝化菌氧化,总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化,用以计算脲的含量。

4.人工模拟酶

在深入了解酶的结构与功能以及催化作用的机制的基础上,近10年来,有许多科学家模拟酶的生物催化功能,用化学半合成法或化学全合成法合成了人工酶催化剂。

①半合成酶:例如将电子传递催化剂[Ru(NH)3]3+与巨头鲸肌红蛋白结合,产生了一种 半合成的无机生物酶 ,这样把能和氧气结合而无催化活性的肌红蛋白变成能氧化各种有机物(如抗坏血酸)的半合成酶,它接近于天然的抗坏血酸氧化酶的催化效率。

②全合成酶:全合成酶不是蛋白质,而是一些非蛋白质有机物,它们通过并入酶的催化基团与控制空间构象,从而像天然酶那样专一性地催化化学反应。例如利用环糊精成功地模拟了胰凝乳蛋白酶、RNase、转氨酶、碳酸酐酶等。其中胰凝乳蛋白模拟酶催化简单酯反应的速率和天然酶接近,但热稳定性与pH稳定性大大优于天然酶,模拟酶的活力在80℃仍能保持,在pH2~13的大范围内都是稳定的。

生物酶工程

生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来的,是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。因此它亦可称为高级酶工程。

自从70年代初DNA重组技术问世以来,把酶学推进到一个十分重要的发展时期,使它的基础研究和应用研究领域发生着巨大的革命性变化,产生了生物酶工程。

生物酶工程主要包括三个方面:(1)用DNA重组技术(即基因工程技术)大量地生产酶(克隆酶);(2)对酶基因进行修饰,产生遗传修饰酶(突变酶);(3)设计新的酶基因,合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。

酶基因的克隆和表达技术的应用使我们有可能克隆各种天然的蛋白基因或酶基因。先在特定的酶的结构基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列,再将此片段克隆到一定的载体中,然后将带有特定酶基因的上述杂交表达载体转化到适当的受体细菌中,经培养繁殖,再从收集的菌体中分离得到大量的表达产物——我们所需要的酶。一些来自于人体的酶制剂,如治疗血栓栓塞病的尿激酶原,就可以用此法取代从大量的人尿中的提取。此外还有组织纤溶酶原激活剂(TPA)与凝乳酶等一百多种酶的基因已经克隆成功,其中一些还已进行了高效的表达。此法产生出大量的酶,并易于提取分离纯化。

近几年兴起的另一个新研究领域:酶的选择性遗传修饰,即酶基因的定点突变。研究者们在分析氨基酸序列弄清酶的一级结构及X线衍射分析弄清酶的空间结构的基础上,再在由功能推知结构或由结构推知功能的反复推敲下,设计出酶基因的改造方案,确定选择性遗传修饰的修饰位点。现在人们已掌握技术,所以只要有遗传设计蓝图,就能人工合成出所设计的酶基因。酶遗传设计的主要目的是创制优质酶,用于生产昂贵特殊的药品和超自然的生物制品,以满足人类的特殊需要。

需要改善的酶学性质包括:对热、氧化剂、非水溶剂的稳定性;对蛋白水解作用的敏感性;免疫原性;最适pH、离子强度及温度;催化效率;对底物和辅助因子的专一性与亲合力;反应的主体化学选择性;催化效率;别构效应;反馈抑制;多功能性;在纯化或固定化过程中酶的功能和理化性质等。目前的关键问题在于如何设计超自然的优质酶基因,即如何作出优质酶基因的遗传设计蓝图。







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